34 Tidak semua jenis bakteri mampu memproduksi inhibitory metabolites
senyawa penghambat pada media agar karena terdapat kemungkinan produksi inhibitory metabolites akan lebih banyak jika kultur dilakukan pada media broth.
Adanya perbedaan komposisi medium juga mempengaruhi produksi senyawa penghambat Verschuere et al. 2000. Hal tersebut membuktikan bahwa
penghambatan pertumbuhan populasi tidak selalu dapat dilihat melalui metode zona bening Kirby Bauer Method.
Lactid Acid Bacteria LAB yang diisolasi dari saluran pencernaan mampu memproduksi komponen bakteriosin yang mampu menghambat pertumbuhan
mikroorganisme lainnya dan secara tidak langsung akan mempengaruhi kompetisi dalam memperoleh energi di lingkungannya. LAB yang ditemukan dalam saluran
pencernaan organisme akuatik seperti ikan mampu meningkatkan status kesehatan organisme tersebut Verschuere et al. 2000. Sasanti 2005 melaporkan bahwa
dari 110 isolat hasil isolasi dari terumbu karang, hanya 10 isolat saja yang potensial sebagai kandidat probiotik. Lima diantaranya terbukti mampu
menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi MR 5339 Rf R walaupun tidak menunjukkan adanya zona hambat pada uji in vitro.
Untuk mengetahui tingkat kepadatan bakteri yang dikultur sebelum masuk ketahapan kultur bersama, dilakukan pengukuran kepadatan bakteri dengan
menggunakan spektrofotometer. Kepadatan bakteri diketahui dengan mengukur nilai optical density OD dari populasi sel yang dikultur selama 24 jam.
Pengukuran OD dilakukan pada panjang gelombang 600 nm lampiran 1.
3.5 Uji Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik
Uji ini dilakukan untuk melihat tingkat kelangsungan hidup pascalarva PL17 udang vaname setelah diberi kandidat probiotik. Uji patogenisitas
dilakukan terhadap isolat-isolat yang menunjukkan daya hambat terhadap pertumbuhan Vibrio harveyi MR 5339 Rf R pada tahap kultur bersama. Uji
patogenisitas dilakukan terhadap empat bakteri kandidat terbaik berdasarkan hasil kultur bersama Gambar 2 yaitu isolat F5, F17, F19, dan F43. Kontrol positif
yang digunakan adalah patogen V. harveyi MR 5339 Rf R. Uji patogenisitas dilakukan dengan enam perlakuan dimana masing-masing perlakuan dan dua
35 ulangan. Pengamatan tingkat kelangsungan hidup pascalarva udang vaname
dilakukan selama 5 hari. Tingkat kelangsungan hidup pascalarva udang vaname tertera pada gambar 3.
Keterangan: A: Penambahan dengan konsentrasi 10
6
CFUml B: Penambahan dengan konsentrasi 10
7
CFUml C: Penambahan dengan konsentrasi 10
8
CFUml
Gambar 3. Tingkat kelangsungan hidup pascalarva udang vaname pada uji patogenisitas kandidat probiotik
Berdasarkan hasil uji patogenisitas dengan berbagai konsentrasi diketahui bahwa semua isolat kandidat probiotik yang diujicobakan tidak bersifat patogen
terhadap pascalarva udang vaname Gambar 3. Hal ini dibuktikan dengan tingkat kelangsungan hidup pascalarva udang vaname yang diberi kandidat probiotik
yang tinggi yaitu berkisar antara 85-100, sedangkan kontrol positif penambahan V. harveyi sebesar 60-70.
3.6 Pembuatan Mutan Bakteri Kandidat Probiotik
Empat isolat terpilih hasil seleksi in vitro yang terbukti mampu menekan pertumbuhan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R dan tidak bersifat patogen pada
pascalarva udang vaname dibuat mutan terhadap antibiotik sebelum digunakan
95 100
100 100
70 100
95 95
85 65
100 95
95 100
60
20 40
60 80
100 120
F 5 F 17
F 19 F 43
Kontrol positif
K ela
ng sun
g a
n hid up
A B
C
36 pada uji in vivo. Empat isolat yaitu F5, F17, F19, dan F43 dibuat mutan secara
spontan dengan cara menyebar biakan cair isolat pada media SWC agar yang mengandung streptomisin 50 µgml. Isolat yang tumbuh resisten pada media
SWC yang mengandung streptomisin diambil sebagai inokulan untuk uji in vivo. Bentuk dan ciri fisik isolat mutan tidak berbeda dengan isolat awalnya.
Isolat F5 memiliki ciri berbentuk bulat, tepian rata, elevasi cembung, dan koloni berwarna putih susu Gambar 4a. Hasil identifikasi genus merujuk pada metode
identifikasi Cowan 1974 menunjukkan isolat F5 tergolong anggota genus Kurthia. Isolat F17 memiliki ciri koloni berbentuk bulat, tepian rata, elevasi
cembung, berwarna putih, dan teridentifikasi sebagai anggota genus Micrococcus Gambar 4b. Isolat F19 memiliki ciri koloni berbentuk bulat, berwarna putih
susu, tepian rata, berelevasi cembung, dan teridentifikasi sebagai anggota genus Chromobacterium, Beneckea, Vibrio, Plesiomonas, dan Aeromonas. Isolat F43
memiliki ciri koloni berwarna putih, berbentuk bulat kecil, tepian rata, berelevasi cembung dan teridentifikasi sebagai anggota genus Kurthia.
a. b.
c. d. Gambar 4. Penampilan mutasi spontan isolat a F5; b F17; c F19; dan d F43
pada media SWC agar
37
3.7 Uji in vivo Kandidat Probiotik
