23 pemeliharaan pascalarva. Jenis antibiotik yang digunakan adalah rifamfisin,
streptomisin, kanamisin, dan penisilin G. Konsentrasi yang digunakan adalah 50 µgml dan 100 µgml. Kandidat probiotik ditumbuhkan pada media SWC agar
yang telah mengandung antibiotik dengan konsentrasi 50 µgml dan 100 µgml menggunakan metode streak plate lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28
o
C. Bakteri yang sensitif terhadap antibiotik ditandai dengan tidak adanya
pertumbuhan koloni pada media SWC agar yang telah mengandung antibiotik, sedangkan bakteri yang resisten akan tetap tumbuh pada media tersebut.
2.1.4 Metode kultur bersama
Kemampuan kandidat bakteri probiotik melawan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R diuji juga dengan menggunakan metode kultur bersama. Isolat bakteri
kandidat probiotik dan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R yang telah berumur 24 jam diencerkan hingga mencapai kepadatan yang sama yakni mencapai
10
6
CFUml. Sebanyak 100 µl bakteri kandidat probiotik dan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R dimasukkan kedalam media SWC broth, lalu diinkubasi selama 24
jam pada shaker berkecepatan 140 rpm dengan suhu 29
o
C. Sebagai kontrol digunakan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R yang ditumbuhkan sendiri tanpa
bakteri kandidat probiotik dengan kepadatan yang sama. Kemampuan bakteri kandidat probiotik menghambat pertumbuhan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R
ditandai dengan kepadatan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R pada perlakuan kontrol yang lebih banyak dibandingkan dengan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R
pada hasil kultur bersama.
2.1.5 Uji patogenitas bakteri kandidat probiotik
Sebanyak satu lup inokulan dari masing-masing isolat ditumbuhkan pada media SWC broth dan diinkubasi pada shaker dengan kecepatan 140 rpm pada
suhu 29
o
C. Hasil kultur disentrifuse pada 4000 rpm selama 30 menit lalu dibilas dengan Posphate Buffer Saline sebanyak dua kali. Suspensi bakteri kandidat
probiotik dimasukkan dalam media steril pemeliharaan larva udang vaname hingga mencapai kepadatan akhir 10
6
, 10
7
, dan 10
8
CFUml. Percobaan dilakukan sebanyak dua kali ulangan dengan kontrol positif berupa penambahan bakteri
24 V. harveyi MR 5339 Rf R. Pemberian pakan dilakukan sebanyak 5 kali sehari
dengan menggunakan pelet berjenis crumble. Pengamatan tingkat kelangsungan hidup dilakukan setiap hari selama 5 hari Vijayan et al. 2006.
2.1.6 Pembuatan mutan bakteri kandidat probiotik
Isolat-isolat yang menghasilkan kelangsungan hidup terbaik pada uji patogenisitas, diberi penanda resisten streptomisin St R terlebih dahulu sebelum
digunakan pada uji in vivo. Pemberian penanda streptomisin dilakukan dengan menumbuhkan isolat secara spontan pada media SWC agar yang mengandung
streptomisin sebanyak 50 µgml media. Sedangkan patogen yang digunakan adalah V. harveyi MR 5339 Rf R yang ditumbuhkan secara spontan pada media
SWC yang mengandung 50 µgml rifamfisin. Pemberian penanda ini dilakukan untuk memonitor keberadaan bakteri pada media pemeliharaan.
2.2 Uji in vivo Kandidat Probiotik
