Definisi Operasional. Prosedur penelitian yang dilakukan Alat dan Bahan Penelitian

commit to user 38 dengan VCD 80mgkgBB; Kelompok Perlakuan II sebanyak 20 ekor yaitu tikus yang mendapat perlakuan dengan VCD 160mgkgBB.

E. Variabel Penelitian. 1.

Variabel bebas. Kadar 4-vynilcyclohexene diepoxide VCD.

2. Variabel terikat.

Kerusakan stroma ovarium.

F. Definisi Operasional.

1. 4-Vinyl Cyclohexene Diepoxide VCD adalah hasil metabolisme dari 4- Vinylcyclohexene VCH. Yang diencerkan dan di beri emulgator sesame oil yang telah disesuaikan dengan berat badan tikus dan di suntikkan secara intraperitonial. 2. Stroma ovarium merupakan jaringan penyokong dari proses hormonal dan fertilitas tikus pada usia reproduksi 3. Kerusakan stroma ovarium adalah adanya suatu kerusakan pada jaringan stroma ovarium yang dapat berupa fibrotik, kekosongan area stroma, penyempitan pembuluh darah, iskemia, atau nekrosis.

G. Prosedur penelitian yang dilakukan

1. Pemilihan mencit 2. Penimbangan mencit 3. Pemberian tanda 4. Pengelompokan mencit 5. Penyuntikan VCD intraperitoneal commit to user 39 6. Pembedahan abdomen mencit 7. Pengambilan ovarium mencit 8. Pemeriksaan histopatologi ovarium

H. Alat dan Bahan Penelitian

Pembuatan Slide jaringan a. Alat: - Cassette tissue - Beaker glass - Mikrotom - Poly L-Lysine slides - Deckglass - Humidity chamber vertical - Humidity chamber horisontal - Mikro pipet 10 µl - Mikro pipet 100 µl - Mikro pipet 1000 µl - PCR tube - Shaker b. Bahan - Formalin buffer 10 - Alkohol 100, 95, 80, 70. - Xylol - Parafin - Aquadest - Buffer sitrat pH 6 - PBS pH 7,2 - 7,4 - Metanol H 2 O 2 0,3 - Bloking serum - Streptavidin -Substrat enzim peroksidase: DAB - Hematoxylin - Canada balsam - Kapas atau tissue c. Reagen: - 4-vinylcyclohexane diepoxide sigma commit to user 40 - antibodi anti estrogen sigma - antibodi anti mouse reseptor estrogen alfa sigma - antibodi caspase 3 sigma

I. Cara Kerja

a.Perlakuan tikus 1. Subyek penelitian yang dipilih yaitu tikus betina galur Wistar sebanyak 60 ekor. Berdasarkan masa puber tikus pada umur 28 hari, maka mulai umur 21 hari dilakukan pemisahan tikus dari induknya. Pada umur 28 hari dilakukan sinkronisasi birahi dengan cara penyuntikkan PMSG intramuskular dosis 5-8 iu 0,1 cc. 2. Sampel penelitian dibagi ke dalam 3 kelompok secara acak, yaitu kelompok kontrol, kelompok I VCD 80 mgkgBB dan kelompok II VCD 160 mgkgBB. Kelompok kontrol terdiri dari 20 tikus yang diberikan injeksi sesame oil secara intraperitoneal. Kelompok II terdiri dari 20 tikus yang diberikan suntikan VCD 80 mg kgBB pengenceran dengan sesame oil 1:40. Kelompok 3 terdiri dari 20 tikus yang diberikan suntikan VCD 160 mg kgBB pengenceran dengan sesame oil 1:40. 3. Kelompok I II diberikan suntikan VCD secara intraperitoneal sekali setiap hari selama 15 hari. 4. Sebelum diberikan suntikan VCD dan setiap 5 hari dilakukan ovorektomi pada dua tikus pada kelompok perlakuan. Pada tikus kelompok kontrol dilakukan ovorektomi pada hari ke-0, ke-5, ke-10 dan hari ke-15 masing- masing 5 tikus. commit to user 41 5. Ovarium dikirim ke laboratorium PA FK UGM Yogyakarta untuk dilakukan blok paraffin dan dipotong dengan mikrotom menjadi preparat PA. b.Pembuatan Slide jaringan 1 Fiksasi Fiksasi berfungsi untuk mempertahankan struktur sel sehingga menjadi stabil secara fisik dan kimiawi dan mencegah terjadinya dialysis atau pembengkakan pada ruptur. Fiksasi dilakukan dengan menggunakan larutan formalin buffer 10. 2 Dehidrasi Dehidrasi berfungsi untuk menarik air dalam jaringan. Untuk proses dehidrasi digunakan alkohol 70 hingga 100. 3 Clearing Clearing berfungsi untuk menghilangkan menarik alkohol dalam jaringan, memberikan warna bening pada jaringan, serta sebagai zat perantara masuknya ke dalam parafin. Proses clearing menggunakan larutan xylol. 4 Infiltrasi Parafin Setelah clearing, jaringan kemudian dimasukkan ke dalam parafin cair pada suhu 57-59 o C selama ±4 jam. Hal ini berfungsi untuk mengisi pori-pori dalam jaringan. commit to user 42 5 Embedding Jaringan yang sudah selesai di proses dikeluarkan dan segera dinasukkan ke dalam cetakan blok yang sebelumnya sudah diisi dengan parafin cair hingga mengeras selama ±20 menit. 6 Pemotongan dengan mikrotom Sebelum dipotong dengan mikrotom, blok didinginkan dengan pemberian batu es selama 15 menit. Blok dijepitkan pada mikrotom kemudian dipotong dengan pisau mikrotom dengna kemiringna 30 terhadap blok parafin setebal 2,5 mikron. Hasil potongan yang berupa pita dimasukkan ke dalam waterbath yang sebelumnya telah diisi dengan air yang dihangatkan sebanyak 50 C, kemudian diambil dengan objek glass dan diberi nomor dengan pensil kaca sesuai nomor registrasi blok, dibiarkan 5 menit, kemudian diinkubasi. 7 Pengecatan Staining a Deparafinisasi dengan memasukkan preparat xylol I, II, III masing- masing selama 3 menit b Rehidrasi dengan memasukkan preparat ke alkohol 100, 95, 80, dan 70 masing-masing selama 2 menit c Preparat dimasukkan ke air mengalir selama 3 menit d Pengecatan inti dengan memasukkan ke Mayer Hematoksilin selama 7 menit e Preparat dimasukkan ke air mengalir selama 7 menit commit to user 43 f Counter stain dengan memasukkan ke larutan Eosin selama 30 detik g Dehidrasi dengan memasukkan ke dalam alkohol 70, 80, 95, dan 100 masing-masing 3 celupan h Clearing dengan memasukkan ke dalam xylol I dan II masing- masing selama 2 menit. i Mounting dengan meneteskan 1 tetes Entelan dan dek glass. c.Pembacaan a Pembacaan dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran 10x. b Stroma ovarium terdiri dari sel yang berbentuk spindlefibroblast,berhubungan dengan pematangan folikel c Sel terdiri dari lemak cytoplasmik dan dikelilingi serat retikulin,menyerupai miofibrioblastik d Pembuluh darah di sekitar stroma ovarium

J. Analisis Data