Arif Dharmawan S500907009

commit to user

TOKSISITAS 4-VYNILCYCLOHEXENE DIEPOXIDE (VCD)

TERHADAP STROMA OVARIUM

Studi pada tikus galur Wistar ( Rattus Novergicus Lam )

(Studi Pendahuluan)

TESIS

Disusun untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Derajat Magister Kesehatan Program Studi Magister Kedokteran Keluarga

Minat Utama Ilmu Biomedik

Oleh:

Arif Dharmawan

S500907009

PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA 2012

commit to user

ii

Halaman Pengesahan Tesis

TOKSISITAS 4-VYNILCYCLOHEXENE DIEPOXIDE (VCD) TERHADAP STROMA OVARIUM

Disusun Oleh:

Arif Dharmawan

S500907009

Telah Disetujui oleh Tim Pembimbing untuk

Komisi

Pembimbing Nama Tanda Tangan Tanggal

Pembimbing I Dr.Sri Sulistyowati, dr., Sp.OG (K) NIP. 196208221989122001

…………. ………

Pembimbing II Prof.Dr.J.B.Dalono , dr., Sp.OG (K) NIP. 194105041970041001

.………… ………

Ketua Program Studi Magister Kedokteran Keluarga

Dr. Hari Wujoso, dr.,SpF,M.M NIP. 196210221995031001

commit to user

iii

TOKSISITAS 4-VYNILCYCLOHEXENEDIEPOXIDE (VCD) TERHADAP STROMA OVARIUM

Studi Pendahuluan pada tikus galur Wistar ( Rattus Novergicus Lam )

Disusun Oleh:

Arif Dharmawan

S500907009

Telah Disetujui oleh Tim Penguji

Pada hari : Tanggal :

Jabatan Nama Tanda Tangan

Ketua Dr. Hari Wujoso, dr.,SpF,M.M NIP. 196210221995031001

Sekretaris Prof. Dr. Harsono Salimo, dr.,SpA NIP. 19483131976101001

Anggota Penguji 1. Dr. Sri Sulistyowati, dr., Sp.OG(K) NIP. 196208221989122001 2. Prof. Dr.JB. Dalono,dr, Sp.OG (K) NIP. 194105041970041001 Mengetahui,

Ketua Program Studi Magister

Kedokteran Keluarga

Dr. Hari Wujoso, dr.,SpF,M.M NIP. 196210221995031001

Direktur Program Pascasarjana

Prof.Dr.Ir.Ahmad Yunus, MS NIP 196107171986011

commit to user

iv

PERNYATAAN

Nama : Arif Dharmawan

NIM : S500907009

Menyatakan dengan sesungguhnya bahwa tesis berjudul Toksisitas

4-Vynilcyclohexene Diepoxide (VCD) Terhadap Stroma Ovarium adalah

betul-betul karya sendiri. Hal-hal yang bukan karya saya, dalam tesis tersebut diberi tanda citasi dan ditunjukkan dalam daftar pustaka.

Apabila di kemudian hari terbukti pernyataan saya tidak benar, maka saya bersedia menerima sanksi akademik berupa pencabutan tesis dan gelar yang saya peroleh dari tesis tersebut.

Surakarta, Juni 2012 Yang membuat pernyataan

commit to user

v

KATA PENGANTAR

Assalamualaikum Wr. Wb.

Alhamdulillahirobbilalamin Yaa Allah, segala puji dan syukur saya panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan Rahmat, Taufik dan Hidayah Nya sehingga saya dapat menyelesaikan tesis ini yang disusun untuk memenuhi persyaratan dalam mengikuti Program Studi Dokter Spesialis I di Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret serta untuk memenuhi persyaratan mencapai derajat Magister Kesehatan di Program Studi Magister Kesehatan Universitas Sebelas Maret Surakarta dengan judul “Toksisitas

4-VynilcyclohexeneDiepoxide (VCD) Terhadap Stroma Ovarium ”.

Terimakasih yang tak terhingga dan penghargaan yang sebesar-besarnya saya sampaikan kepada Dr.Hj. Sri Sulistyowati, dr., Sp.OG(K) sebagai pembimbing I yang dengan penuh perhatian dan kesabaran telah memberikan dorongan, bimbingan, dan saran di tengah kesibukan beliau yang begitu padat masih berkenan meluangkan waktu untuk memberi petunjuk, dalam proses penyelesaian tesis ini.

Terimakasih yang tak terhingga dan penghargaan yang sebesar-besarnya juga saya sampaikan kepada Prof. Dr. JB Dalono, dr., Sp.OG (K) dan A Laqif,

dr SpOG (K) sebagai pembimbing II yang dengan penuh perhatian dan kesabaran

telah memberikan dorongan, bimbingan, dan saran serta arahan, memecahkan masalah yang timbul dan ikut membantu dalam proses penyelesaian tesis ini.

Terimakasih yang tak terhingga dan penghargaan yang sebesar-besarnya juga saya sampaikan kepada Dr. Abkar Raden, dr., Sp.OG (K) sebagai koordinator tesis yang telah memberikan dorongan, waktu dan kesempatan yang seluas-luasnya dalam proses penyelesaian tesis ini.

Terimakasih yang tak terhingga dan penghargaan yang sebesar-besarnya juga saya sampaikan kepada tim penguji, yang telah berkenan memberikan waktu dan tenaga dalam proses penyelesaian tesis ini.

commit to user

vi

Dengan selesainya tesis ini, perkenankanlah pada kesempatan ini saya mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya dan rasa hormat setinggi-tingginya kepada yang terhormat:

1. Prof. Dr. Ravik Karsidi, M.Si., sebagai Rektor Universitas Sebelas

Maret Surakarta.

2. Prof. Dr. Ir. Ahmad Yunus, MS sebagai Direktur Pascasarjana

Universitas Sebelas Maret Surakarta.

3. Dr. Hari Wujoso, dr.,SpF,M.M, sebagai Ketua Program Studi Magister

Kedokteran Keluarga Universitas Sebelas Maret Surakarta.

4. Prof. Dr. Zainal Arifin Adnan, dr., Sp.PD-KR., sebagai Dekan

Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.

5. Basoeki Sutardjo, drg., MMR., sebagai Direktur RSUD Dr. Moewardi

Surakarta.

6. Dr. Supriyadi Hari R, dr., Sp.OG., sebagai Ka. Bag SMF Obgin

Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.

7. Dr. Sri Sulistyowati, dr., Sp.OG (K)., sebagai KPS SMF Obgin

Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.

8. Affi Agelia dr.SpOG. Mkes., sebagai SPS SMF Obgin Fakultas

Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.

9. Seluruh Staff PPDS I Bagian Obgin Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. Prof. Dr. JB Dalono, dr., Sp.OG (K)., Dr.

Soetrisno, dr., Sp.OG (K)., Dr. Supriyadi Hari R, dr., Sp.OG., Dr. Abkar Raden, dr., Sp.OG (K)., Rustam Sunaryo, dr., Sp.OG, Glondong Suprapto, dr., Sp.OG, Darto, dr., Sp.OG, Dr. Sri Sulistyowati, dr., Sp.OG (K)., A. Laqief, dr., Sp.OG (K)., Prof. Dr. KRMT. Tedja D.O, dr., Sp.OG (K)., Tribudi, dr., Sp.OG (K)., Eriana Melinawati, dr., Sp.OG (K)., Heru Priyanto, dr., Sp.OG (K)., Wuryatno, dr., Sp.OG., Glondong Suprapto, dr., Sp.OG., Hermawan U, dr., Sp.OG., Teguh Prakosa, dr., Sp.OG., Wisnu Prabowo, dr., Sp.OG., Affi Angelia R, dr., Sp.OG., Muh. Adrianes Bachnas, dr., Sp.OG., Eric Edwin, dr., Sp.OG.

commit to user

vii

10. Saya juga mengucapkan banyak terima kasih kepada H. Rusbandi, dr.

SpOG Kepala Bagian Obstetri dan Ginekologi RSU Sragen, Nugroho Adiwarso, dr SpOG Kepala Bagian Obstetri dan ginekologi RSU Blora, Eka Budi W, dr. MKes., SpOG Kepala Bagian Obstetri dan Ginekologi

RSU Wonogiri, H. Suroso, dr. SpOG Kepala Bagian Obstetri dan Ginekologi RSU Kebumen, H. Suwaryo Madsukadi, dr. SpOG Kepala Bagian Obstetri dan Ginekologi RSU Cepu, L Budiadi, dr SpOG Kepala bagian Obstetri dan Ginekologi RSU Pandanarang Boyolali yang selalu memberikan bimbingan dan memberi kesempatan kami untuk belajar dan menimba pengalaman di rumah sakit jejaring tersebut.

11. Prof.Kuniarsih, drh, MVSc., PhD , Kepala Bagian Patologi Fakultas

Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta beserta semua staf dan tenaga tehnis atas izin dan kesempatan yang diberikan untuk menggunakan fasilitas laboratorium dalam penelitian tesis ini.

12. Semua rekan residen PPDS I Obgin Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta yang banyak membantu dalam pelaksanaan tesis ini. Kepada para dokter muda/co-asisten , bidan dan paramedik saya ucapkan terima kasih atas kerjasamanya yang baik selama masa pendidikan ini.

13. Ayahanda H.Untung Hadi Purwanto (Alm) dan ibunda Hj.Itje

Mariam BSA, yang telah membesarkan saya, mengasuh, membimbing

dan mendidik disiplin kepada saya dengan penuh kasih sayang, memberikan dorongan, fasilitas serta mendoakan kelancaran selesainya pendidikan dan tesis ini.

14. Ayah dan ibu mertua, keluarga H.Zuhri Amin,SH, (Alm) dan

Hj Endang Pertiwi serta Kakek dan nenek ,H Ali Murtadho dan Hj.Siti Nur Halimah yang telah banyak membantu, memberikan

dorongan, serta mendoakan kelancaran selesainya pendidikan dan tesis ini.

commit to user

viii

15. Istri saya tercinta, dr.Nur Aeni Mulyaningsih yang telah banyak berkorban selama saya mengikuti pendidikan PPDS I Obgin,dan tetap mendorong, mendoakan, dan memberikan semangat sampai saya dapat menyelesaikan pendidikan dan tesis ini.

16. Anak saya, Fairuz Zahiya Meuthia Dharmawan yang dapat menerima dan memahami kesibukan saya dan juga mendorong semangat saya untuk menyelesaikan pendidikan dan tugas tesis ini.

17. Saudaruku dr.Prima Isnaeni sekeluarga, Khusnul Laela,ST serta saudara-saudara iparku, Nur Farida Yuliastuti,ST sekeluarga, Nur

Indah Tri Setyowati,SPsi sekeluarga, drg Nur Solecha Wahyu Lestari sekeluarga, Nur Zulaicha Soraya S.Ked, Nur Fatmawati K,SKG. yang telah banyak membantu serta mendorong semangat saya

untuk menyelesaikan pendidikan tugas tesis ini.

18. Semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu yang telah banyak membantu saya dalam penyelesaian tesis ini.

Akhir kata semoga tesis ini bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan, dan semoga Allah SWT melimpahkan rahmat dan karuniaNya kepada kita semua. Amin Yaa Robbal Alamin.

Wassalamualaikum Wr Wb.

commit to user

ix DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL...……….…... i

HALAMAN PENGESAHAN PEMBIMBING... ii

HALAMAN PENGESAHAN PENGUJI TESIS...………… iii

PERNYATAAN ... iv

KATA PENGANTAR ... v

DAFTAR ISI………... ix

DAFTAR GAMBAR……….... xii

DAFTAR TABEL... xiii

DAFTAR SINGKATAN………... xiv

ABSTRAK... xv

BAB.I. PENDAHULUAN ... 1

A. Latar belakang ... 1

B. Rumusan Masalah ... 3

C. Tujuan penelitian ... 3

D. Manfaat penelitian ... 3

BAB. II. TINJAUAN PUSTAKA... 4

A. Stroma Ovarium... 4

1. Endokrinologi Ovarium ... 5

commit to user

x

3. Pertumbuhan Folikel ... 11

4. Peran Stroma pada Fungsi Ovarium ... 13

5. Kategori Kerusakan Ovarium ... 15

B. 4-Vynilcyclohexene Diepoxide (VCD) ... 18

1. Definisi ... 18

2. Mekanisme Seluler Ovotoksisitas ... 18

3. Mekanisme Molekuler Ovotoksisitas .. ... 20

4. Apoptosis pada Ovarium oleh Pengaruh VCD .. ... 23

5. Premature Ovarian Failure ….. ... 26

C. Kerangka Konseptual ... 32

Keterangan Kerangka Konsep ... 33

D. Hipotesis ... 34

BAB III. METODE PENELITIAN ... 35

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 35

B. Lokasi dan Waktu Penelitian ... 36

C. Subjek Penelitian ... 36

D. Besar sampel .. ... 36

E. Varibel Penelitian .. ... 38

F. Definisi Operasional .. ... 38

G. Prosedur Penelitian yang Dilakukan .. ... 38

H. Alat dan Bahan Penelitian ... 39

I. Cara Kerja .. ... 40

commit to user

xi

BAB IV. HASIL DAN ANALISA PENELITIAN ... 44

A. Hasil Penelitian ... 44

B. Analisis Data Penelitian ... 44

BAB V. PEMBAHASAN ... 49

BAB VI. KESIMPULAN DAN SARAN ... 51

A. KESIMPULAN ... 51

B. SARAN ... 51

commit to user

xii

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Regulasi Saluran Reproduksi Wanita... 6 Gambar 2. Skematik Perkembangan Ovarium pada Fetus dan Dewasa .. ... 8 Gambar 3. Oogenesis dan folikulogenesis pada tikus ... 11 Gambar 4. Aktivitas sekresi faktor pertumbuhan. ... 14 Gambar 5. Penyempitan pembuluh darah Ovarium ... 17 Gambar 6. Sruktur kimia 4- vynilcyclohexene dan 4-vynilcyclohexene

diepoxide ... 18 Gambar 7. Kerangka Konsep ... 32 Gambar 8. Rancangan Penelitian .. ... 35

commit to user

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 2.1. Etiologi terjadinya Premature Ovarian Failure ... 27 Tabel 4.1. Resume hasil pemeriksaan kerusakan stroma ovarium. ... 44 Tabel 4.2. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma

ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 0 ... 45 Tabel 4.3. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma

ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 5 ... 46 Tabel 4.4. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma

ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 10 ... 47 Tabel 4.5. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma

ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 15 ... 48 Tabel 4.6. Hasil uji McNemar tentang perubahan kerusakan stroma

ovarium pada hari ke 5, hari ke 10, dan hari ke 15

commit to user

xiv

DAFTAR SINGKATAN

Cu : Cuprum

DNA : Deoxyribonucleic Acid FSH : Follicle Stimulating Hormone GnRH : Gonadotropine Releasing Hormone IGF : Insulin Growth Factor

IL : Interleukin

LH : Luteinisation Hormone mRNA : Mutation Ribonucleic Acid POF : Premature Ovarian Failure SOD : Superoxide Dismutase TNFα : Tumor Necrosing Factor α VCD : 4-Vinylcyclohexane Diepoxide VCH : 4-Vinylcyclohexene

commit to user

xv

Arif Dharmawan. 2012. Toksisitas 4-Vynilcyclohexene Diepoxide (VCD) terhadap Stroma Ovarium. TESIS. Pembimbing I: Dr.Sri Sulistyowati, dr.,

Sp.OG (K), II: Prof.Dr.J.B.Dalono , dr., Sp.OG (K). Program Studi Kedokteran Keluarga, Program Pascasarjana, Universitas Sebelas Maret Surakarta.

ABSTRAK

Latar Belakang: Sistem reproduksi wanita terdiri dari ovarium, tuba

uterina, uterus, vagina, dan genitalia eksterna. Sebagian besar ovarium berada intraperitoneal dan tidak dilapisi oleh peritoneum. Sebagian besar dari ovarium, baik korteks maupun medula, terdiri dari stroma. Stroma ovarium terdiri dari sel-sel yang berbentuk spindel yang mirip dengan fibroblas dan tersusun dalam suatu bentukan yang khas. Tidak seperti jaringan ikat pada umumnya, stroma ovarium tersusun dari banyak sel dengan serat yang menyokongnya (baik serat retikuler maupun jaringan kolagen biasa). Sel-sel terdiri atas cytoplasmic lipid dan dikelilingi oleh suatu serat retikulin. Beberapa sel menyerupai gambaran seperti miofibroblastik dan immunoreaktif dengan smooth muscle actin (SMA) dan desmin. Sel-sel stroma ovarium berhubungan dengan pematangan folikel, yang juga berkaitan erat dengan fungsi endokrin dan sekresi estrogen.

Pada studi ini peneliti mencoba merancang suatu hewan model untuk menyerupai kondisi alami proses menopause pada wanita. Penelitian dilakukan dengan menginduksikan agen kimia yang bersifat ovotoksik, 4-vinylcyclohexane

diepoxide (VCD) pada tikus galur Wistar untuk mempelajari proses kerusakan

pada ovarium. Telah diketahui bahwa VCD dapat menyebabkan terjadinya POF pada folikel ovarium hewan uji tikus. Namun masih belum diketahui pengaruhnya terhadap stroma ovarium yang merupakan jaringan penyangga dari ovarium. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui adanya pengaruh VCD terhadap stroma ovarium.

Tujuan: Untuk melihat efek toksisitas VCD terhadap stroma ovarium pada

tikus .

Metode penelitian: Penelitian dilakukan di laboratorium Patologi Fakultas

Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada, merupakan penelitian obervasional laboratorium dengan pendekatan pretest -postest control group design. Variabel independen: dosis VCD, variabel dependen: Stroma ovarium pada Premature

Ovarian Failure. Jumlah sampel 60, dibagi dalam 3 grup (kontrol, perlakuan 80

mg/KgBB, dan perlakuan 160 mg/KgBB), Purposive Random Sampling. Analisis data dengan uji chi Square, menggunakan SPSS versi 17.00 for Windows.

Hasil Penelitian: Hasil studi menunjukkan bahwa tidak didapatkan

perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian VCD dengan dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB selama 15 hari, yang merupakan dosis yang telah menyebabkan terjadinya kerusakan folikel ovarium yang menyerupai POF, tidak menyebabkan terjadinya kerusakan stroma ovarium.

commit to user

xvi

Arif Dharmawan. 2012. Toxicity of 4-Vynilcyclohexene Diepoxide (VCD) through the Ovarin Stroma. DISSERTATION. Supervisor I: Dr.Sri

Sulistyowati, dr., Sp.OG (K), II: Prof.Dr.J.B.Dalono , dr., Sp.OG (K). Program Study of Medical Family, Post-graduate Program of Sebelas Maret University Surakarta.

ABSTRACT

Background: Women reproduction system is consist of ovary, uterine

tube, uterus, vagina, and external genitalia. Most of ovary, both cortex and medulla, consist of stroma. Ovarian stromas are spindle formed cells, looks like fibroblast and also lapped on typical form. Ovarian stroma has different form, it lapped on many cells with fibers that contributing on these cells (reticular fibers and collagen tissue). Cells are consist of cytoplasmic lipid and rounded by reticulin fibers. Some cells have form like miofibroblastic and immunoreactive with smooth muscle actin (SMA) and desmin. Ovarian stromal cells are related to follicle maturity, that also thightly related to endocrine function and estrogen secretion.

. In this study, observer is trying to stake out an animal model to become resemble of natural condition of menopause that happen in women. This study is done by inducted ovotoxic substance, 4-vinylcyclohexane diepoxide (VCD),in the wistar mices to examine the prosses of damage thata happen on ovary. It is known that VCD can cause POF on ovarian follicle on mice’s ovary. But, there is still unknown the effect of this substance on ovarian stroma. Ovarian stroma is a supporting tissue for ovary. This study is done for knowing the effect of VCD to the ovarian stroma.

Objectives: to examine the toxicity effect ofVCD through ovarian stroma of mice.

Methods: Research is done in Laboratory of Patology, Animal Medicine

Faculty, Gadjah Mada University. It is an observational laboratory research with pretest-posttest controlled group design. Independent variable is dose of VCD, dependent variable is ovarian stroma on Premature Ovarian Failure. We used 60 samples, devided inti 3 groups (control, treatment 80 mg/KgBW, and treatment 160 mg/KgBW), Purposive random sampling. Data analysis with Chi Square

examination, using SPSS version 17.0 for Windows.

Result: The result of this study shows that there is no significant differences between control group and treatment groups. It shows that induction of VCD on dose of 80 mg/KgBW and 160 mg/KgBW as long as 15 days, that is the dose to make the damages to ovarian follicle that resemble to POF, does not cause of damaging the ovarian stroma.

commit to user BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Perindustrian membawa dampak positif dan negatif pada kehidupan manusia. Salah satu dampak negatif industri pada kesehatan wanita adalah kegagalan ovarium dini akibat paparan kronis zat ovotoksik. Ovotoksisitas merupakan salah satu penyebab kegagalan ovarium dini (premature ovarian

failure). Premature ovarian failure ditandai dengan amenore, hipoestrogen

dan peningkatan kadar hormon gonadotropin yang menetap sebelum usia 40 tahun. Wanita yang menderita premature ovarian failure akan mengalami gejala-gejala menopause (Shelling, 2010; Shuster et al, 2010). Menopause berkaitan erat dengan berbagai masalah kesehatan (Hu, et al., 2001).

Premature ovarian failure (POF) atau menopause dini adalah suatu

keadaan dimana terjadi amenorhea yang disebabkan oleh berhentinya fungsi ovarium sebelum usia 40 tahun. Wanita dengan POF mengalami anovulasi dan hipoestrogenisme dengan adanya amenorhea primer atau sekunder, infertilitas, defisiensi hormon steroid sex, dan peningkatan gonadotropin (Conway, 2000). Rata-rata usia menopause wanita eropa adalah sekitar 51 tahun. Namun, 1-3% dari seluruh wanita mengalami POF, termasuk di dalamnya 10-28% dari wanita dengan amenorhea primer dan 4-18% dari wanita yang mengalami amenorhea sekunder (Lanying, 2001). Sebagian besar kasus POF merupakan keadaan idiopatik (Pal dan Santoro, 2002).

commit to user

Beberapa agen kimia bersifat toksik terhadap ovarium yang dapat menginduksi kerusakan folikel dan mengakibatkan kegagalan ovarium dini. Paparan agen ovotoksik ini bermanifestasi pada risiko jangka panjang terkait kegagalan ovarium dini pada wanita (Hu et al., 2001). Pada studi ini peneliti mencoba merancang suatu hewan model untuk menyerupai kondisi alami proses menopause pada wanita. Peneliti melakukan induksi agen kimia yang bersifat ovotoksik, 4-vinylcyclohexane diepoxide (VCD) pada tikus galur Wistar untuk mempelajari proses kerusakan pada ovarium. VCD merupakan hasil metabolit dari 4-vinylcyclohexane (VCH) yang didapatkan sebagai agen hasil manufaktur pada pembuatan pestisida, bahan berbasis karet, dan plastik. Agen kimia ini mempunyai selektifitas untuk merusak folikel primordial dan primer pada ovarium melalui proses induksi atresia secara alami (Hoyer dan Sipes, 2007).

Tikus betina galur Wistar yang diinduksi dengan VCD secara intraperitoneal dapat digunakan untuk mengetahui proses kegagalan ovarium melalui atresia. Pada studi ini dilakukan evaluasi kadar estrogen, gambaran morfologis folikel ovarium beserta stroma ovariumnya, ekspresi estrogen reseptor alfa dan caspase 3 secara imunohistokimia.

Pada studi ini peneliti mencoba meneliti toksisitas 4-vynilcyclohexene

diepoxide (VCD) terhadap stroma untuk merancang suatu hewan model

untuk menyerupai kondisi alami proses menopause, sehingga dapat digunakan untuk penelitian lebih lanjut mengenai menopause.

commit to user B. Rumusan Masalah

Berdasar uraian diatas dapat dirumuskan untuk masalah penelitian yaitu: Apakah 4-vynilcyclohexene diepoxide (VCD) dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB menyebabkan kerusakan stroma ovarium?

C. Tujuan penelitian

1. Tujuan Umum

Untuk melihat efek toksisitas 4-vynilcyclohexene diepoxide (VCD) terhadap stroma ovarium pada tikus.

2. Tujuan Khusus

Mengetahui toksisitas 4-vynilcyclohexene diepoxide (VCD) terhadap

stroma ovarium.

D. Manfaat Penelitian

1. Manfaat teoritis

Memberikan pengetahuan tentang pengaruh 4-vynilcyclohexene

diepoxide (VCD) terhadap jaringan stroma yang dapat digunakan untuk

memperkaya khasanah keilmuan.

2. Manfaat Klinis

Menambah pengetahuan tentang pemeriksaan laboratorium biomolekuler gambaran jaringan stroma ovarium akibat paparan

4-vynilcyclohexene diepoxide (VCD) sehingga dapat digunakan untuk

commit to user BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A.Stroma Ovarium

Sistem reproduksi wanita terdiri dari ovarium, tuba uterina, uterus, vagina, dan genitalia eksterna. Ovarium berwarna putih dan terdiri dari jaringan fibrosa yang tebal yang menjadi tempat melekatnya ovum. Ovarium pada wanita dewasa berukuran panjang kira – kira 4 cm, lebar dan tebal kurang lebih 1,5 cm (Sarwono, 2008).

Ovarium terletak pada lapisan belakang ligamentum latum. Sebagian besar ovarium berada intraperitoneal dan tidak dilapisi oleh peritoneum. Ovarium terhubung ke uterus dengan ligamentum ovarii propium. Dan pembuluh darah ke ovarium melalui ligamentum suspensorium ovarii. Ovarium merupakan tempat berkembangnya folikel-folikel hingga menjadi folikel de Graaf, yang akhirnya akan melepaskan ovum saat wanita mengalami ovulasi. Ovarium diliputi oleh epitel coelom yang dapat berubah menjadi epitel torak berambut getar, yang memproduksi cairan jernih seperti ditemukan dalam tuba atau epitel tidak berambut getar yang memproduksi musin seperti pada endometrium (Bychkov, 2002).

Sebagian besar dari ovarium, baik korteks maupun medula, terdiri dari stroma. Stroma ovarium terdiri dari sel-sel yang berbentuk spindel yang mirip dengan fibroblas dan tersusun dalam suatu bentukan yang khas. Tidak seperti jaringan ikat pada umumnya, stroma ovarium tersusun dari banyak sel dengan

commit to user

serat yang menyokongnya (baik serat retikuler maupun jaringan kolagen biasa). Sel-sel terdiri atas cytoplasmic lipid dan dikelilingi oleh suatu serat retikulin. Beberapa sel menyerupai gambaran seperti miofibroblastik dan immunoreaktif dengan smooth muscle actin (SMA) dan desmin. Sel-sel stroma ovarium berhubungan dengan pematangan folikel, yang juga berkaitan erat dengan fungsi endokrin dan sekresi estrogen (Ganong, 2005).

1. Endokrinologi ovarium

Dalam endokrinologi reproduksi wanita, ovarium memiliki dua fungsi utama, yaitu fungsi proliferatif dan fungsi sekretorik. Sebagai fungsi proliferatif (generatif), ovarium merupakan sumber ovum selama masa reproduksi. Di dalam ovarium terjadi petumbuhan folikel primer, folikel de Graaf, peristiwa ovulasi, serta pembentukan corpus luteum. Sedangkan sebagai fungsi sekretorik (vegetatif), ovarium merupakan tempat pembentukan dan pengeluaran hormon steroid yaitu hormon estrogen, progesteron, dan androgen (Sarwono, 2008).

Pandangan umum dari interaksi faktor-faktor hormon pada sistem reproduksi wanita ditunjukkan pada gambar 1. Sistem hormon wanita terdiri dari otak, hipofise, ovarium, dan organ reproduksi ( tuba, uterus, cerviks dan vagina). Didalam otak, hipotalamus menghasilkan gonadotropin releasing

hormone (GnRH) yang mengatur sekresi luteinizing hormone (LH) dan

commit to user

Gambar 1. Regulasi saluran reproduksi pada wanita

Ovarium matur mempunyai dua fungsi utama yaitu, maturasi sel germinal ( folikulogenesis) dan steroidogenesis. Tiap sel germinal pada akhirnya berkembang didalam folikel, yang merupakan sumber utama penghasil hormone steroid selama siklus menstruasi. Saat ovulasi, ovum dilepaskan dan folikel yang pecah berubah menjadi korpus luteum, yang mensekresi progesteron. FSH terutama berperan pada stimulasi perkembangan folikel ovarium, sedangkan LH memicu terjadinya ovulasi. FSH dan LH mengatur steroidogenesis di folikel dan sekresi androgen dan estrogen, dan LH mengatur sekresi progesteron dari korpus luteum. Steroid

commit to user

ovarium akan menghambat sekresi LH dan FSH kecuali pada saat akan terjadi ovulasi ( midcycle), estradiol menyebabkan umpan balik positif pada aksis hipotalalamus- hipofisis dan secara bermakna memicu peningkatan sekresi GnRH, LH dan FSH. Ovarium juga menghasilkan tiga hormone polipeptida yaitu inhibin yang menekan sekresi FSH, activin (activin-binding protein) meningkatkan sekresi FSH, dan follistatin (activin-binding protein) yang menurunkan sekresi FSH (Speroff, 2005; Hutt et al, 2005).

2. Folikulogenesis

a. Ovarium Dewasa

Ovarium berisi tiga bagian yaitu korteks luar, medulla di sentral dan pintu ovarium (hillus). Hillus berisi pembuluh syaraf, pembuluh darah dan sel hillus yang menjadi aktif dalam proses steroidogenesis atau mampu membentuk tumor. Sel ini sangat mirip dengan sel leydig di testis yang memproduksi testosteron. Bagian korteks yang paling luar disebut tunika albuginea, yang bagian atasnya ditutupi oleh satu lapis sel kuboid. Oosit berhubungan dengan kompleks yang disebut folikel. Bagian dalam korteks tertanam dekat dengan jaringan stroma. Jaringan stroma terdiri atas jaringan penunjang dan sel interstitial yang berasal dari sel mesenkim dan mempunyai kemampuan untuk berespon terhadap

luteinizing hormone (LH ) atau human chorionic gonadotropin ( hCG )

dan produksi androgen. Daerah tengah medulla dari ovarium sebagian besar berasal dari sel mesonefrik (Speroff, 2005).

commit to user

Gambar 2. Skematik Masa Perkembangan Ovarium pada Fetus dan Dewasa (Diambil dari Speroff, 2005)

commit to user b. Ovarium tikus

Pada masa perkembangan ovarium tikus dari lahir hingga dewasa, terjadi perubahan dari organ simpel menjadi organ yang multiform. Dalam perkembangannya, pada ovarium terjadi pertumbuhan, differensiasi, serta degenerasi.

Ovarium pada waktu tikus lahir terdiri dari 2 tipe sel utama, yaitu oosit dan sel stroma multipotensial. Disebut multipotensial karena secara morfologi, sel ini akan berdifferensiasi menjadi berbagai sel penyokong antara lain sel granulosa, sel teka baik interna maupun eksterna, sel lutein, serta bentuk sel yang lain (Schwiebert, 2007).

Pada saat lahir, ovarium tikus merupakan organ solid yang berisi penuh dengan sel germinal dan sel stroma. Organ ini dilapisi oleh adanya sel-sel epitel yang disebut sebagai epitel germinal walaupun sebenarnya epitel ini bukan merupakan bagian dari sel germinal. Oosit mengisi sebagian besar organ, kecuali bagian tengah dari pusat stroma.

Usia pubertas tikus bervariasi tergantung pada jenis tikus, status nutrisi, serta adanya pengaruh lingkungan, namun secara umum pubertas tikus terjadi pada usia antara 28 hingga 49 hari. Tanda-tanda terjadinya pubertas pada tikus betina adalah adanya pembukaan vagina dan munculnya sel epitel terkornifikasi pada vaginal smear. Fertilitas pada tikus betina paling banyak terjadi pada usia 75 hingga 300 hari.

Tikus merupakan organisme yang polyestrous. Tikus betina akan berovulasi setiap 4 sampai 5 hari sekali (dengan beberapa variasi), dan

commit to user

biasanya terjadi pada malam hari. Ovulasi terjadi secara spontan, biasanya terjadi 8-11 jam setelah onset estrus, namun ovulasi tidak selalu terjadi pada setiap siklus estrus. Pap vagina digunakan untuk menentukan tahap siklus estrus. Kopulasi pada tikus biasanya terjadi pada malam hari dan dapat dikonfirmasi dengan adanya plug senggama di vagina selama 12-24 jam pasca kopulasi (Schwiebert, 2007).

Sel-sel germinal folikel primordial akan berproliferasi dan migrasi ke dalam gonad yang belum berdiferensiasi. Pada periode post natal, sel-sel germinal akan terpecah dan menjadi folikel primordial yang terus berkembang menjadi folikel primer. Estrogen (E2) menghambat sel germinal menjadi folikel primordial. Pada tikus yang kekurangan faktor-faktor transkripsi oosit seperti NOBOX, SOHLH1, SOHLH2, and LHX8, maka akan terjadi kematian folikel, baik folikel primordial maupun folikel primer. Kematian dapat pula terjadi bahkan sebelum terbentuk folikel primordial (Richards dan Pangas, 2010).

Secara morfologi, pembentukan ovarium pada tikus betina tidak aktif, namun kejadian di tingkat molekuler paling banyak terjadi pada tahap gonadogenesis. Terdapat lebih dari 1200 ekspresi gen yang mengatur perkembangan gonad tikus betina pada hari ke-10 sampai hari ke-13 post koital. Periode tersebut menentukan diferensiasi jenis kelamin gonadal tikus. Peningkatan ekspresi penghambat siklus sel (seperti inhibitor

cyclin-dependen kinase) dan beberapa gen penanda meiosis terjadi pada gonad

commit to user

proliferasi sel somatik dihambat ketika se-sel germinal ovarium memasuki tahap meiosis (Uzumchu dan Zachow, 2007).

Gambar 3. Oogenesis dan folikulogenesis pada tikus. (Sumber: Richards dan Pangas, 2009)

3. Pertumbuhan Folikel

Seperti pada masa pubertas, pada ovarium dewasa terjadi stadium pembentukan folikel yang akan terus berulang. Pada awalnya oosit akan membesar dan sel granulosa berproliferasi. Pada sat ini oosit berbentuk masa bulat yang solid. Teka interna akan terbentuk pada stadium awal. Zona pellucida mulai terbentuk (Calvanesea, et al, 2005).

Sekarang diketahui bahwa proses pembentukan folikel primer sampai ovulasi berlangsung selama 85 hari. Pada masa ini tidak tergantung gonadotropin sehingga kemudian mencapai keadaan yang siap untuk berespon terhadap rangsangan FSH untuk pertumbuhan folikel. Bila terjadi

commit to user

peningkatan gonadotropin seperti yang terlihat pada awal siklus haid, akan terlihat pematangan folikel yang tergantung pada FSH. Jumlah folikel yang matur tergantung pada jumlah FSH dan sensitifitas folikel terhadap gonadotropin. Ekspresi reseptor FSH paling banyak pada sel granulosa, namun bisa juga dijumpai pada epitel di permukaan ovarium dan epitel tuba fallopii, yang fungsinya belum diketahui, tapi diduga berperan pada tumor epitelial (Gosden, et al, 2009).

Pertama kali antrum terlihat sebagai sejumlah kavum intragranulosa yang disebut badan cell – exner yang digambarkan oleh Emma Call dan Siegmund Exner di Vienna pada tahun 1875. Pada satu titik saat pembentukan ini, folikel akan terhenti dan mengalami proses apoptosis yang dikenal sebagai atresia. Pada awalnya, komponen sel granulosa mulai mengalami perpecahan. Kavum antral akan diserap dan kavum akan kolaps dan mengalami obliterasi. Oosit akan berdegenerasi in situ. Akhirnya, jaringan parut yang berbentuk pita yang berada disekitar sel teka akan terlihat. Terkadang masa sel teka akan mengalami kehilangan lipid dan sulit dibedakan dengan massa stroma yang sedang tumbuh. Oleh karena itu, proses apoptosis akan berlanjut pada granulosa dan lapisan teka merupakan bagian terbesar dari jaringan interstitial. Sebelum mengalami regresi, folikel kistik akan berada di korteks untuk beberapa saat. (Speroff, 2005 )

commit to user 4. Peran Stroma pada Fungsi Ovarium

Sebagian besar dari ovarium, baik korteks maupun medula, terdiri dari stroma. Stroma ovarium terdiri dari sel-sel yang berbentuk spindel yang mirip dengan fibroblas dan tersusun dalam suatu bentukan yang khas. Tidak seperti jaringan ikat pada umumnya, stroma ovarium tersusun dari banyak sel dengan serat yang menyokongnya (baik serat retikuler maupun jaringan kolagen biasa). Sel-sel terdiri atas cytoplasmic lipid dan dikelilingi oleh suatu serat retikulin. Beberapa sel menyerupai gambaran seperti miofibroblastik dan immunoreaktif dengan smooth muscle actin (SMA) dan desmin. Sel-sel stroma ovarium berhubungan dengan pematangan folikel, yang juga berkaitan erat dengan fungsi endokrin dan sekresi estrogen.

Selama perkembangan folikel, stroma ovarium yang mengelilingi folikel tersebut akan berdiferensiasi menjadi teka interna dan teka eksterna. Proses ini mulai berlangsung pada saat janin dalam kandungan dan berakhir setelah menopause. Teka interna biasanya terdiri dari tiga atau empat lapisan yang berbatasan dengan struktur granulosa. Sedangkan struktur stroma yang lain dengan batas yang kurang begitu jelas diantara folikel disebut sebagai teka eksterna (Hall & Guyton, 2006).

Teka interna pada folikel yang berkembang merupakan jaringan yang kaya akan vaskularisasi terdiri dari kapiler-kapiler yang dilatasi dan mengelilingi tiap-tiap sel. Sel-sel pada teka interna mempunyai

commit to user

bentuk yang bervariasi dari bulat hingga berbentuk poligonal, dengan diameter antara 12-20 um, berwarna kemerahan dan bersitoplasma jernih dengan adanya vakuola dan nukleus di bagian sentral.

Teka interna merupakan jaringan yang menyokong perkembangan folikel karena merupakan tempat terjadinya steroidogenesis. Namun, fungsi endokrin dari sel teka eksterna masih belum diketahui secara pasti. Sel teka interna pada folikel adalah sumber utama estrogen dalam darah dimana terdiri dari tetesan lipid, retikulum endoplasma yang halus dan luas, dan mitokondria yang memiliki krista tubuler. Androgen dari sel teka diproses menjadi estrogen dalam sel granuloma. Estrogen yang dihasilkan dari granuloma ini kemudian memasuki sirkulasi (Ganong, 2005).

Gambar 4. Aktivitas sekresi faktor pertumbuhan. (Knight and Glister, 2006).

commit to user 5. Kategori Kerusakan Stroma Ovarium

Stroma ovarium merupakan jaringan penyokong yang memungkinkan ovarium untuk menjalankan fungsi normalnya. Kerusakan yang terjadi pada stroma dapat berpengaruh pada fungsi ovarium. Pada

Premature Ovarian Failure (POF), kerusakan folikel terjadi karena adanya

proses apoptosis folikel itu sendiri. Tidak terjadi kerusakan pada jaringan penyokong ovarium (stroma). Akan tetapi kerusakan pada stroma dapat pula menyebabkan terjadinya keadaan yang mirip dengan POF, yaitu terjadinya kerusakan folikel.

Perubahan-perubahan yang dapat terjadi pada kerusakan stroma antara lain adalah terjadinya pembesaran fibroblas, hyalinisasi yang prominen, dan terjadinya penyempitan pembuluh darah.

a. Fibrotik

Salah satu kemungkinan kerusakan yang dapat terjadi pada stroma ovarium adalah terjadinya proses hyalinisasi yang prominen dan berakhir pada proses fibrotik. Proses ini dikaitkan dengan adanya inflamasi, nekrosis lemak, histosit yang berbusa, pembentukan plak kolesterol, serta pembentukan makrofag hemosiderin.

Pada beberapa keadaan misalnya pemberian kemoterapi pada pasien kanker, agen kemoterapi yang diberikan dapat berpengaruh pada jaringan ovarium yang dapat menimbulkan terjadinya respon inflamasi jaringan. Akibatnya inti sel membengkak, pleomorfik, dan hiperkromatik serta menunjukkan adanya penggumpalan kromatin.

commit to user

Sitoplasma sel menjadi granular, bervakuola, dan terjadi dilatasi serta kerusakan pada pada organela sitoplasma yang dihubungkan dengan terjadinya destruksi lisosom (Chew et al., 2009).

b. Kekosongan area stroma

Kerusakan pada stroma ovarium dapat menyebabkan penurunan fungsi jaringan stroma. Penurunan ini terutama terjadi jika didapatkan adanya perubahan morfologi jaringan stroma. Penelitian yang dilakukan pada domba dan kambing mengenai kerusakan folikel dan stroma menunjukkan beberapa perubahan yang terjadi pada kerusakan stroma ovarium. Diantara perubahan itu adalah terjadinya lisis membran sel stroma, nekrosis stroma yang dikaitkan dengan adanya kekosongan area jaringan stroma, serta terjadinya penurunan densitas kolagen dan fibrin pada jaringan ovairum karena terjadinya kerusakan pada struktur folikuler (Faustino et al., 2010).

c. Penyempitan pembuluh darah

Suplai darah ke ovarium merupakan suatu sistem end artery, yaitu tidak didapatkan adanya sistem anastomose. Karena keadaan ini, apabila terjadi penyempitan atau penyumbatan pembuluh darah akan mengakibatkan hilangnya aliran darah ke ovarium. Kurangnya suplai darah ini akan menyebabkan terjadinya fokal fibrosis. Selain itu, kurangnya suplai darah ke ovarium akan menyebabkan penurunan jumlah folikel premordial ovarium yang tampak terutama pada daerah dengan korteks ovarium yang kekurangan suplai (Motta et al., 2002).

commit to user

Kerusakan dan obstruksi pembuluh darah ovarium dapat menyebabkan terjadinya iskemia lokal yang berefek pada penghancuran segmental pada korteks ovarium normal serta terjadinya penurunan jumlah folikel premordial yang signifikan. Korteks ovarium yang rusak tersebut akan digantikan oleh jaringan fibrotik dengan disertai hilangnya fungsi normal ovarium. Apabila keadaan ini terjadi pada seluruh korteks ovarium, maka akan dimungkinkan ovarium untuk kehilangan seluruh cadangan folikel premordial yang dimilikinya dan seluruh jaringan korteks ovarium akan digantikan dengan jaringan parut. Keadaan ini merupakan suatu kerusakan ovarium total yang permanen (Meirow, et al., 2007).

Gambar 5. penyempitan pembuluh darah yang terjadi pada pembuluh darah ovarium (kiri), dan gambaran pembuluh darah ovarium normal (kanan).

commit to user B. 4- VynilcyclohexeneDiepoxide (VCD)

1. Definisi

4-Vinyl Cyclohexene Diepoxide (VCD) adalah hasil metabolisme

dari 4-Vinylcyclohexene (VCH). 4-Vinylcyclohexene (VCH) terbentuk dari dimerisasi dari 1,3-butadin pada perusahaan karet sintetis, insektisida, pembuat plastik. 4-Vinylcyclohexene (VCH) akan dimetabolisme tubuh melalui sitokrom 450 katalis epoxidasi (Xiaoming Hu et al., 2001). 4-Vinyl

Cyclohexene Diepoxide (VCD) sudah lama diketahui sebagai bahan

ovotoksik (Terutaka Kodama et al, 2009). Pada pemberian 4-Vinyl

Cyclohexene Diepoxide secara intraperitoneal selama 30 hari

menghasilkan penurunan jumlah folikel ovarium pada tikus dan mencit (Hoyer et al, 2001).

VCH: Rumus kimia= C8H12, Berat molekul= 108,18

VCD: Rumus kimia= C8H12O2, Berat molekul= 140,18

Gambar 6. Sruktur kimia 4- vynilcyclohexene dan 4-vynilcyclohexene diepoxide. (Sumber: Keating et al, 2008)

2. Mekanisme Seluler Ovotoksisitas

Peran VCD dalam menghasilkan kerusakan luas pada folikel telah lama diidentifikasi. Pemberian VCD secara langsung akan merusak folikel primordial dan folikel primer yang terlihat pada hari ke 12 sehingga

commit to user

menyebabkan penurunan jumlah folikel secara signifikan (Hoyer dan Sipes, 2007). Pada ovarium mamalia, jumlah folikel primordial yang dapat berkembang sampai ovulasi jumlahnya kecil, karena kebanyakan dari sel tersebut akan mengalami atresia, kematian sel ini disebut apoptosis yang terjadi secara fisiologis dan berbeda dengan nekrosis yang merupakan respon terhadap jejas atau inflamasi. Apoptosis dan nekrosis berbeda dalam karakteristik morfologi. Perbandingan perubahan ultrastruktur pada folikel preantral kontrol dan yang diberi VCD menunjukan bahwa gambaran oosit dalam folikel yang tidak sehat pada kedua kelompok sama. Termasuk gangguan organela, peningkatan jumlah vakuola, akumulasi komponen membran, dan segmentasi abnormal (cleavage). Gambaran morfologi degenerasi selama atresia, tidak berubah pada pemberian VCD tetapi VCD meningkatkan proses ini dan atresia terjadi dalam frekuensi yang lebih tinggi (Hoyer et al, 2001).

Meskipun karakteristik morfologi merupakan metode yang paling reliabel untuk membedakan antara apoptosis dan nekrosis, juga dapat dibedakan dengan petanda biokimia dan molekuler. Salah satu gen pada mamalia yang berkaitan secara spesifik dengan apoptosis adalah Bcl-2 yang bersifat proto-onkogen. Bcl-2 telah diidentifikasi pada membran luar mitokondria, retikulum endoplasma, membran inti, dan berhubungan dengan lamanya sel bertahan hidup. Gen lain dari famili Bcl-2 adalah Bax yang rangkaiannya homolog. Rasio protein Bax terhadap Bcl-2 dalam sel akan menentukan apakah akan terjadi apoptosis (rasio meningkat) atau sel

commit to user

akan bertahan hidup (rasio menurun) (Hsu dan Hsueh, 2000). Pengamatan terhadap jumlah protein bax pada mRNA yang mengkode kematian sel menunjukan terdapat peningkatan signifikan jumlah protein Bax dibandingkan dengan kontrol (sebanyak 72 %, p < 0.005) pada 10 hari pemberian VCD. Hal ini memberikan bukti keterlibatan bax protein dalam ovotoksisitas yang diinduksi oleh VCD dan mendukung hipotesis kematian sel yang disebabkan oleh VCD terjadi melalui apoptosis (Hoyer et al, 2001).

3. Mekanisme Molekuler Ovotoksisitas

Ovarium mengandung berbagai macam enzim yang bertugas untuk melakukan biotransformasi dan detoksifikasi berbagai bahan ovotoksik. Enzim tersebut diantaranya epoxidehydrolase, glutathione S-transferases, dan cytochrome P-450 (Johnson et al., 2004). Mekanisme enzimatik utama detoksifikasi adalah hidrasi untuk membentuk diol (yang dikatalisis oleh microsomalepoxidehydrolase) dan konjugasi dengan gluttion (yang dikatalisis oleh glutathione S-transferase). Pada studi isolasi in vitro folikel ovarium diketahui bahwa folikel ovarium dapat mengubah secara langsung VCD menjadi bentuk inaktif tetrol yaitu 4-(1,2- dihydroxy)

ethyl-1,2-dihydroxycyclohexane. Namun jika dibandingkan dengan folikel ovarium

dengan ukuran lebih besar, folikel ovarium kecil menunjukan kapasitas paling rendah dalam detoksifikasi VCD, sehingga hal ini membuat folikel preantral kecil sebagai target utama ovotksisitas VCD (Muhammad et al., 2009).

commit to user

Antioksidan secara alami terdapat dalam sel, termasuk ovarium seperti glutathione peroxidase, superoxide dismutase (SOD), dan katalase. Antioksidan ini berfungsi sebagai enzim yang berespon terhadap stress oksidatif karena melindungi sel dari efek merusak dari reactive oxygen species dan apoptosis. Terdapat 3 isoform Superoxide Dismutase, yaitu Manganese Superoxide Dismutase yang terdapat pada mitochondria, copper/zinc Superoxide Dismutase yang terdapat pada sitosol, dan secreted Superoxide Dismutase yang disekresikan ke ruang ektstraseluler. Peningkatan masing-masing isoform ini memberi petunjuk terhadap komponen molekuler yang terlibat.

Pemberian VCD meningkatkan level mRNA Manganese Superoxide Dismutase folikel kecil 148 %, sedangkan peningkatan pada Cu Superoxide Dismutase dan Zn Superoxide Dismutase sekresi tidak meningkat secara bermakna. Sebaliknya pada folikel besar, tidak terjadi efek, hal ini disebabkan tidak terjadi proses stress oksidatif pada folikel besar. Hal ini memberikan bukti bahwa ovotoksisitas yang disebabkan VCD pada folikel kecil terjadi pada mitokondria. Pada kondisi apoptosis, Manganese Superoxide Dismutase juga meningkat secara signifikan, sehingga memberi bukti tambahan bahwa proses ovotoksisitas VCD terhadap ovarium menyerupai menopause (Haas et al., 2007).

Pada mitokondria, juga ada bax protein yang terdapat dalam membran mitokondria. Bax protein terlibat dalam meningkatkan apoptosis melalui interaksi dengan membran mitokondria. Pada pemberian VCD,

commit to user

pada folikel kecil didapatkan peningkatan ekspresi mRNA bax protein. Hal ini juga memberikan bukti tambahan keterlibatan mitokondria intraseluler terhadap apoptosis yang diinduksi oleh VCD. Kerusakan membran mitokondria yang diinduksi oleh bax protein mengakibatkan kerusakan sel yang dapat menyebabkan kebocoran sitokrom c protein dari mitokondria ke sitosol. Pada sebuah studi, dimana dilakukan pengamatan dan analisis ovarium yang telah diinduksi VCD menggunakan mikroskop confocal dengan imuniohistokimia, didapatkan penurunan jumlah folikel, pada pewarnaan khusus yang berikatan dengan sitokrom c protein mitokondria, juga didapatkan peningkatan dan terlihat difus. Pada kondisi normal, sitokrom c protein terlihat fokus dengan intensitas lebih tinggi namun terlokalisasi pada mitokondria, sedangkan gambaran difus terjadi karena sitokrom c protein menyebar ke sitoplasma (Mayer et al., 2002).

Pada apoptosis terjadi aktivasi dari enzim proteolitik caspase 3, demikian juga pada induksi VCD pada ovarium. Aktivasi caspase 3 terjadi pada sitosol selama induksi apoptosis, namun aktivasi caspase 3 juga dapat disebabkan oleh kejadian lain, salah satunya adalah pecahnya mitokondria. Inisiasi ini oleh sitokrom c protein yang dilepaskan mitokondria. Hal ini dibuktikan oleh penelitian dimana didapatkan peningkatan aktivitas caspase 3 pada folikel ovarium kecil dibandingkan kontrol dan folikel ovarium besar (Takai, 2003).

Dari paparan diatas dapat disimpulkan bahwa target dari ovotoksisitas yang induksi VCD adalah mitokondria, terutama pada folikel

commit to user

ovarium kecil. Dan induksi VCD menyebabkan aktivasi mekanisme apoptosis yang terlihat pada Manganese Superoxide Dismutase, bax protein, sitokrom c protein, dan caspase 3.

4. Apoptosis pada Ovarium oleh Pengaruh VCD

Ovarium mengandung berbagai macam enzim yang bertugas untuk melakukan biotransformasi dan detoksifikasi berbagai bahan ovotoksik. Enzim tersebut diantaranya epoxidehydrolase, glutathione S-transferases, dan cytochrome P-450. Mekanisme enzimatik utama detoksifikasi adalah hidrasi untuk membentuk diol (yang dikatalisis oleh microsomalepoxidehydrolase) dan konjugasi dengan gluttion (yang dikatalisis oleh glutathione S-transferase). Pada studi isolasi in vitro folikel ovarium diketahui bahwa folikel ovarium pada dapat mengubah secara langsung VCD menjadi bentuk inaktif tetrol yaitu 4-(1,2- dihydroxy) ethyl-1,2-dihydroxycyclohexane. Namun jika dibandingkan dengan folikel ovarium dengan ukuran lebih besar, folikel ovarium kecil menunjukan kapasitas paling rendah dalam detoksifikasi VCD, sehingga hal ini membuat folikel preantral kecil sebagai target utama ovotksisitas VCD (Devine et al., 2004).

Antioksidan secara alami terdapat dalam sel, termasuk ovarium seperti glutathione peroxidase, superoxide dismutase (SOD), dan katalase. Antioksidan ini berfungsi sebagai enzim yang berespon terhadap stress oksidatif karena melindungi sel dari efek merusak dari reactive oxygen

commit to user

species dan apoptosis. Terdapat 3 isoform Superoxide Dismutase, yaitu Manganese Superoxide Dismutase yang terdapat pada mitochondria, copper/zinc Superoxide Dismutase yang terdapat pada sitosol, dan secreted Superoxide Dismutase yang disekresikan ke ruang ektstraseluler. Peningkatan masing-masing isoform ini member petunjuk terhadap komponen molekuler yang terlibat (Forabosco dan Sforza, 2007).

Pemberian VCD meningkatkan level mRNA Manganese Superoxide Dismutase folikel kecil 148 %, sedangkan peningkatan pada Cu/Zn Superoxide Dismutase dan Superoxide Dismutase sekresi tidak meningkat secara bermakna. Sebaliknya pada foikel besar, tidak terjadi efek, hal ini disebabkan tidak terjadi proses stress oksidatif pada folikel besar. Hal ini memberikan bukti bahwa ovotoksisitas yang disebabkan VCD pada folikel kecil terjadi pada mitokondria. Pada kondisi apoptosis, Manganese Superoxide Dismutase juga meningkat secara signifikan, sehingga member bukti tambahan bahwa proses ovotoksisitas VCD terhadap ovarium menyerupai menopause (Di Pasquale, et al., 2004).

Pada mitokondria, juga ada bax protein yang terdapat dalam membrane mitokondria. Bax protein terlibat dalam meningkatkan apoptosis melalui interaksi dengan membrane mitokondria. Pada pemberian VCD, pada folikel kecil didapatkan peningkatan ekspresi mRNA bax protein. Hal ini juga memberikan bukti tambahan keterlibatan mitokondria intraseluler terhadap apoptosis yang diinduksi oleh VCD. Kerusakan membrane mitokondria yang diinduksi oleh bax protein

commit to user

mengakibatkan kerusakan sel yang dapat menyebabkan kebocoran sitokrom c protein dari mitokondria ke sitosol. Pada sebuah studi, dimana dilakukan pengamatan dan analisis ovarium yang telah diinduksi VCD menggunakan mikroskop confocal dengan imuniohistokimia, didapatkan penurunan jumlah folikel, pada pewarnaan khusus yang berikatan dengan sitokrom c protein mitokondria, juga didapatkan peningkatan dan terlihat difus. Pada kondisi normal, sitokrom c protein terlihat focus dengan intensitas lebih tinggi namun terlokalisasi pada mitokondria, sedangkan gambaran difus terjadi karena sitokrom c protein menyebar ke sitoplasma (Falcone, et al., 2004).

Pada apoptosis terjadi aktivasi dari enzim proteolitik caspase 3, demikian juga pada induksi VCD pada ovarium. Aktivasi caspase 3 terjadi pada sitosol selama induksi apoptosis, namun aktivasi caspase 3 juga dapat disebabkan oleh kejadian lain, salah satunya adalah pecahnya mitokondria. Inisiasi ini oleh sitokrom c protin yang dilepaskan mitokondria. Hal ini dibuktikan oleh studi dimana didapatkan peningkatan aktivitas caspase 3 pada folikel ovarium kecil dibandingkan control dan folikel ovarium besar. Dari paparan diatas dapat disimpulkan bahwa target dari pada ovotoksisitas yang induksi VCD adalah mitokondria, terutama pada folikel ovarium kecil. Dan induksi VCD menyebabkan aktivasi mekanisme apoptosis yang terlihat pada Manganese Superoxide Dismutase, bax protein, sitokrom c protein, dan kaspase 3 (Di Pasquale, et al., 2004).

commit to user

Ketika terjadi deplesi folikel primordial pada ovarium, maka akan terjadi menopause pada wanita. Karena ovarium mengandung oosit dalam jumlah yang terbatas ketika lahir, maka paparan bahan kimia lingkungan dapat menghancurkan folikel primordial sehingga dapat menimbulkan menopause lebih dini.

5. Premature Ovarian Failure (POF)

a. Definisi dan Epidemiologi

Premature ovarian failure (POF) atau dapat disebut pula

menopause dini adalah suatu keadaan dimana terjadi amenorhea yang disebabkan oleh berhentinya fungsi ovarium sebelum usia 40 tahun. Wanita dengan POF mengalami anovulasi dan hipoestrogenisme dengan adanya amenorhea primer atau sekunder, infertilitas, defisiensi hormon steroid sex, dan peningkatan gonadotropin (Conway, 2000). Rata-rata usia menopause wanita eropa adalah sekitar 51 tahun. Namun, 1-3% dari seluruh wanita mengalami POF, termasuk di dalamnya 10-28% dari wanita dengan amenorhea primer dan 4-18% dari wanita yang mengalami amenorhea sekunder (Lanying, 2001).

Menopause dini ditunjukkan dengan amenorhea dan peningkatan hormon gonadotropin yang disebabkan oleh penurunan jumlah total oosit dalam ovarium, dan oleh karenanya, kemungkinan untuk kembalinya fungsi ovarium seperti sebelumnya menjadi tidak ada (Dixit et al., 2004). Pada penelitian awal tentang POF, diketahui bahwa peningkatan serum

commit to user

follicle stimulating hormone (FSH) di atas 40 IU/L menunjukkan suatu

penurunan fungsi dan jumlah folikel ovarium yang permanen (Letur-Konirsch, 2003). Namun pada beberapa penelitian selanjutnya ditemukan peningkatan fungsi ovarium yang intermitten, bahkan hingga mengalami kehamilan pada wanita yang telah didiagnosis POF (Akbari, 2011).

b. Etiologi

Sebagian besar kasus POF merupakan keadaan idiopatik. Meskipun telah dilakukan berbagai penelitian namun sebagian besar kasus masih belum didapatkan penyebab pastinya (Pal dan Santoro, 2002). Sebelumnya, didapatkan anggapan bahwa terjadi deplesi pada folikel ovarium pada semua kasus POF. Namun pada penelitian selanjutnya diketahui bahwa tidak semua kasus POF terjadi deplesi folikel ovarium (Hoyer, 2005). Beberapa kasus POF tidak terjadi deplesi folikel ovarium, folikel tersebut masih ada, namun tidak responsif terhadap stimulasi dengan meningkatkan hormon gonadotropin dalam sirkulasi (van Kasteren, 2001). Secara umum, etiologi POF dapat dibagi menjadi dua kelompok, yaitu hilangnya fungsi ovarium karena deplesi folikel, dan hilangnya fungsi ovarium karena disfungsi folikel dalam ovarium.

Penyebab secara lebih rinci dapat dilihat pada tabel 1 berikut.

Tabel 1. Etiologi terjadinya Premature ovarian Failure (POF) Folicle depletion

Chromosomal Abnormalities X Chromosome

Monosomy X, mosaicism Trisomy X, mosaicism

commit to user

Mutations or deletions of Xq13-Xq26 Isochromosomes

Translocation involving X Fragile X premutations Trisomi 13, 18

Genetic Syndromes Ataxia teleangiectasia Mutations of AIRE gene BEPS Syndrome

Perrault’s Syndrome Metabolic

Mucopolysaccaridosis Galactosemia

Infections Mumps Shigella Malaria Idiopatic Follicle Disfunction

Autoimmune Signal Defect

Gonadotropin or receptor abnormalities Steroidogenic enzymes deficiencies Idiopatic

(Kolp, 2003)

c. Patofisiologi

Pada masa embrionik, yaitu pada usia kehamilan 20 minggu, sel germinal bergerak keluar dari tabung urogenital menuju ke ovarium primitif yang kemudian berproliferasi sehingga membentuk 3,5 juta oosit tiap ovarium. Sebagian besar dari sel germinal ini hancur karena proses apoptosis (Pru dan Tilly, 2001). Ovarium biasanya memiliki jumlah folikel premordial yang sama pada saat hamil, yaitu sekitar 1 juta folikel

commit to user

tiap ovarium. Jumlah ini akan terus berkurang selama hidup karena adanya atresia dan terjadinya ovulasi (Forges et al., 2004). Tidak lebih dari 500 oosit (0,007%) yang dikeluarkan melalui ovulasi selama masa reproduktif seorang wanita (Conway, 2000).

Pada POF idiopatik, terjadi suatu mekanisme yang belum diketahui secara pasti yang menyebabkan terjadinya peningkatan apoptosis oosit. Hal ini dapat mendorong terjadinya penurunan komplemen oosit dalam ovarium pada saat lahir, atau dapat mempercepat terjadinya atresia (Laml et al., 2002).

d. Apoptosis

Apoptosis merupakan suatu komponen yang normal pada perkembangan dan pemeliharaan kesehatan pada organisme multiseluler. Sel yang mati ini merupakan respon terhadap berbagai stimulus dan selama apoptosis sel ini dikontrol dan diregulasi, sel yang mati kemudian difagosit oleh makrofag. Apoptosis berbeda dengan nekrosis, pada nekrosis terjadi kematian sel tidak terkontrol. Sel yang mati pada nekrosis akan membesar dan kemudian hancur dan lisis pada satu daerah yang merupakan respon terhadap inflamasi (Abir, et al. 2004).

Pada apoptosis sel-sel yang mati memberikan sinyal yang diperantarai oleh beberapa gen yang mengkode protein untuk enzym pencernaan yang disebut dengan caspase. Gen caspase ini merupakan bagian dari cystein protease yang akan aktif pada perkembangan sel maupun merupakan sinyal untuk aktif pada destruksi sel tersebut.

commit to user

Kematian sel melalui apoptosis merupakan fenomena yang normal, yaitu terjadi eliminasi sel yang tidak diperlukan lagi. Proses apoptosis secara fisiologis diperlukan untuk (Hoyer, 2005):

i. Terminasi sel

Apoptosis dapat terjadi pada sel yang mengalami kerusakan yang tidak bisa di repair,infeksi virus, keadaan yang mengakibatkan stress pada sel . Kerusakan DNA akibat ionisasi radiasi maupun bahan kimia toxic juga dapat mencetuskan apoptosis melalui aktivasi tumor supresor gen p53. Keputusan untuk apoptosis dapat berasal dari sel itu sendiri, dari jaringan disekitarnya ataupun dari sel yang termasuk dalam sisem imun.

ii. Mempertahankan homeostasis

Pada organisme dewasa, jumlah sel dalam suatu organ atau jaringan harus berada dalam keadaan yang relatif konstan. Proses keseimbangan ini termasuk dalam homeostasis yang dibutuhkan oleh makhluk hidup untuk mempertahankan lingkungan internalnya. Keseimbangan (homeostasis) ini dapat tercapai bila kecepatan mitosis pada jaringan seimbang dengan kematian sel.

iii. Perkembangan embryonal

Kematian sel yang terprogram merupakan bagian dari perkembangan jaringan. Pada masa embryo , perkembangan suatu jaringan atau organ didahului oleh pembelahan sel dan diferensiasi sel yang besar-besaran dan kemudian dikoreksi melalui apoptosis.

commit to user iv. Interaksi limfosit

Perkembangan limfosit B dan Limfosit T pada tubuh manusia merupakan suatu proses yang kompleks , yang akan membuang sel-sel yang berpotensi menjadi rusak. Cytotoksik T sel dapat secara langsung menginduksi apoptosis pada sel melalui terbukanya suatu celah pada target membran dan pelepasan zat-zat kimia untuk mengawali proses apoptosis. Celah ini dapat terjadi melalui adanya sekresi perforin, granul yang berisi granzyme B, serine protease yang dapat mengaktivasi caspase melalui pemecahan residu aspartat.

v. Involusi hormonal

Apoptosis dapat terjadi misalnya pada pelepasan sel endometrium selama siklus menstruasi, regresi pada payudara setelah masa menyusui dan atresia folikel ovarium pada menopause.

commit to user D. KERANGKA KONSEPTUAL

commit to user Keterangan Kerangka Konsep

4-Vinyl Cyclohexene Diepoxide (VCD) yang merupakan hasil

metabolisme dari 4-Vinylcyclohexene (VCH) adalah senyawa yang toksik terhadap folikel ovarium. Pada folikel ovarium stadium antral, terjadi proses detoksifikasi oleh enzim-enzim pelindung ovarium seperti epoxidehydrolase, glutathione S-transferases, dan cytochrome P-450, yang dapat mengubah VCD menjadi metabolit inaktif 4-(1,2- dihydroxy) ethyl-1,2-dihydroxycyclohexane melalui proses hidrasi yang dikatalisasi oleh microsomalepoxidehydrolase, dan konjugasi yang dikatalisis oleh glutathione S-transferase).

Pada folikel yang lebih kecil, aktivitas enzim epoxidehydrolase, glutathione S-transferases, dan cytochrome P-450 tidak sebesar aktivitasnya pada folikel yang besar. Aktivitas yang lebih kecil ini tidak mampu untuk mendetoksifikasi semua VCD menjadi bentuk metabolit yang inaktif. Adanya VCD yang masih aktif pada folikel yang kecil mengakibatkan terjadinya stres oksodatif pada folikel tersebut. Keadaan stres oksidatif ini akan mendorong peningkatan produksi antioksidan alami dalam ovarium seperti glutathione peroxidase, superoxide dismutase (SOD), dan katalase. Antioksidan ini akan bekerja untuk melindungi sel dari kerusakan akibat efek reactive oxygen species dan apoptosis yang disebabkan oleh proses stres oksidatif. Antioksidan ini banyak mengalami peningkatan terutama pada folikel-folikel kecil, sedangkan pada folikel besar tidak terjadi efek antioksidan ini karena

commit to user

pada folikel besar hampir semua VCD diubah menjadi bentuk inaktif sehingga tidak menimbulkan stres oksidatif.

Ketidakseimbangan jumlah antioksidan dan stres oksidatif yang terus timbul menyebabkan ketidakmampuan sel dalam mempertahankan hidupnya. Hal ini menebabkan terjadinya perubahan-perubahan dalam sel berupa perubahan morfologi sel, degradasi DNA, serta akan menghasilkan sinyal apoptosis sel. Sinyal apoptosis ini didapatkan dari peningkatan ekspresi mRNA bax protein. Ekspresi mRNA bax protein ini akan menyebabkan kerusakan membran mitokondria yang dapat menimbulkan kebocoran sitokrom c protein dari mitokondria ke sitosol. Kebocoran sitokrom c ini akan meyebabkan aktivasi apoptosome caspase-9, yang pada akhirnya akan mendorong kematian sel karena proses apoptosis.

4-vynilcyclohexene diepoxide (VCD) merupakan zat kimia yang merusak folikel primordial dan folikel primer ovarium secara selektif dengan cara mempercepat proses alamaiah terjadinya atresia. Karena kerusakan yang terjadi secara selektif, maka tikus akan mengalami kegagalan ovarium secara bertahap, sampai akhirnya hanya tersisa jaringan stroma ovarium, sehingga fungsi steroidogenesis dan folikulogenesis hilang.

E. Hipotesis

4-vinylcyclohexane diepoxide ( VCD ) dosis 80 mg/KgBB dan

commit to user BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian.

1. Jenis Penelitian

Penelitian ini secara eksperimental laboratorium. 2. Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian yang digunakan di penelitian ini adalah pretest

-postest control group design.

commit to user B. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan mulai bulan April 2012 sampai dengan bulan Mei 2012, di lembaga pengembagan penelitian terpadu (LPPT) dan laboratorium Patologi Anatomi Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

C. Subjek Penelitian.

Subjek pada penelitian ini adalah hewan coba tikus betina galur Wistar dengan kreteria inklusi tikus sehat, berumur 2.5 bulan ,berat badan 170 gr, makan dan minum disamakan, suhu ruangan sama . Kreteria eksklusi tikus sakit,gerak tidak aktif,warna bulu kusam dan atau rontok.

D. Besar sampel

Perhitungan jumlah sampel minimum yaitu dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

潐 2� 1 � _{� �}� 1 � � 1 �

(Murti, 2010) Keterangan:

n = ukuran sampel masing-masing dari 2 kelompok sampel

P = perkiraan proporsi (prevalensi) variable dependen pada populasi � = (P1+P2)/2

Z1-α= statisitik Z

α = kesalahan tipe I β = kesalahan tipe II

commit to user

Untuk perhitungan ukuran sampel digunakan software OpenEpi®, maka didapatkan hasil di bawah ini:

Sample Size for Frequency in a Population

Population size(for finite population correction factor or fpc)(N): 1000000 Hypothesized % frequency of outcome factor in the population (p): 50%+/-23 Confidence limits as % of 100(absolute +/- %)(d): 23% Design effect (for cluster surveys-DEFF): 1

Sample Size(n) for Various Confidence Levels

Confidence Level(%) Sample Size

95% 19 80% 8 90% 13 97% 23 99% 32 99.9% 52 99.99% 72 Equation

Sample size n = [DEFF*Np(1-p)]/ [(d2/Z21-α/2*(N-1)+p*(1-p)]

Sample size of group 1 (control) 20 Sample size of group 2 (VCD 80 mg/kgBB) 20 Sample size of group 3 (VCD 160 mg/kgBB) 20 Total sample size 3 groups 60

Results from OpenEpi, Version 2, open source calculator--SSPropor

Jadi dalam penelitian ini secara membutuhkan 60 sampel dengan perincian 20 tikus pada kelompok kontrol dan 40 tikus pada kelompok paparan VCD 80 mg/kgBB dan VCD 160 mg/kgBB (masing-masing kelompok sebanyak 20 tikus).

Sampel penelitian dibagi dalam tiga kelompok yaitu: Kelompok Kontrol sebanyak 20 ekor yaitu tikus yang tidak mendapatkan perlakuan dengan VCD; Kelompok Perlakuan I sebanyak 20 ekor yaitu tikus yang mendapat perlakuan

commit to user

dengan VCD 80mg/kgBB; Kelompok Perlakuan II sebanyak 20 ekor yaitu tikus yang mendapat perlakuan dengan VCD 160mg/kgBB.

E. Variabel Penelitian.

1. Variabel bebas.

Kadar 4-vynilcyclohexene diepoxide (VCD).

2. Variabel terikat.

Kerusakan stroma ovarium.

F. Definisi Operasional.

1. 4-Vinyl Cyclohexene Diepoxide (VCD) adalah hasil metabolisme dari

4-Vinylcyclohexene (VCH). Yang diencerkan dan di beri emulgator sesame oil yang telah disesuaikan dengan berat badan tikus dan di suntikkan secara intraperitonial.

2. Stroma ovarium merupakan jaringan penyokong dari proses hormonal dan fertilitas tikus pada usia reproduksi

3. Kerusakan stroma ovarium adalah adanya suatu kerusakan pada jaringan stroma ovarium yang dapat berupa fibrotik, kekosongan area stroma, penyempitan pembuluh darah, iskemia, atau nekrosis.

G. Prosedur penelitian yang dilakukan

1. Pemilihan mencit 2. Penimbangan mencit 3. Pemberian tanda 4. Pengelompokan mencit

commit to user 6. Pembedahan abdomen mencit

7. Pengambilan ovarium mencit 8. Pemeriksaan histopatologi ovarium

H. Alat dan Bahan Penelitian

Pembuatan Slide jaringan a. Alat:

- Cassette tissue - Beaker glass

- Mikrotom - Poly L-Lysine slides

- Deckglass - Humidity chamber vertical

- Humidity chamber horisontal - Mikro pipet 10 µl

- Mikro pipet 100 µl - Mikro pipet 1000 µl

- PCR tube - Shaker

b. Bahan

- Formalin buffer 10% - Alkohol 100%, 95%, 80%, 70%.

- Xylol - Parafin

- Aquadest - Buffer sitrat pH 6 - PBS pH 7,2 - 7,4 - Metanol H2O2 0,3%

- Bloking serum - Streptavidin -Substrat enzim peroksidase: DAB - Hematoxylin - Canada balsam - Kapas atau tissue c. Reagen:

commit to user - antibodi anti estrogen (sigma)

- antibodi anti mouse reseptor estrogen alfa (sigma) - antibodi caspase 3 (sigma)

I. Cara Kerja

a.Perlakuan tikus

1. Subyek penelitian yang dipilih yaitu tikus betina galur Wistar sebanyak 60 ekor. Berdasarkan masa puber tikus pada umur 28 hari, maka mulai umur 21 hari dilakukan pemisahan tikus dari induknya. Pada umur 28 hari dilakukan sinkronisasi birahi dengan cara penyuntikkan PMSG intramuskular dosis 5-8 iu (0,1 cc).

2. Sampel penelitian dibagi ke dalam 3 kelompok secara acak, yaitu kelompok kontrol, kelompok I (VCD 80 mg/kgBB) dan kelompok II (VCD 160 mg/kgBB). Kelompok kontrol terdiri dari 20 tikus yang diberikan injeksi sesame oil secara intraperitoneal. Kelompok II terdiri dari 20 tikus yang diberikan suntikan VCD 80 mg /kgBB (pengenceran dengan sesame oil 1:40). Kelompok 3 terdiri dari 20 tikus yang diberikan suntikan VCD 160 mg /kgBB (pengenceran dengan sesame oil 1:40). 3. Kelompok I & II diberikan suntikan VCD secara intraperitoneal sekali

setiap hari selama 15 hari.

4. Sebelum diberikan suntikan VCD dan setiap 5 hari dilakukan ovorektomi pada dua tikus pada kelompok perlakuan. Pada tikus kelompok kontrol dilakukan ovorektomi pada hari ke-0, ke-5, ke-10 dan hari ke-15 masing-masing 5 tikus.

commit to user

5. Ovarium dikirim ke laboratorium PA FK UGM Yogyakarta untuk dilakukan blok paraffin dan dipotong dengan mikrotom menjadi preparat PA.

b.Pembuatan Slide jaringan 1) Fiksasi

Fiksasi berfungsi untuk mempertahankan struktur sel sehingga menjadi stabil secara fisik dan kimiawi dan mencegah terjadinya dialysis atau pembengkakan pada ruptur. Fiksasi dilakukan dengan menggunakan larutan formalin buffer 10%.

2) Dehidrasi

Dehidrasi berfungsi untuk menarik air dalam jaringan. Untuk proses dehidrasi digunakan alkohol 70% hingga 100%.

3) Clearing

Clearing berfungsi untuk menghilangkan/ menarik alkohol dalam jaringan, memberikan warna bening pada jaringan, serta sebagai zat perantara masuknya ke dalam parafin. Proses clearing menggunakan larutan xylol.

4) Infiltrasi Parafin

Setelah clearing, jaringan kemudian dimasukkan ke dalam parafin cair pada suhu 57-59oC selama ±4 jam. Hal ini berfungsi untuk mengisi

commit to user 5) Embedding

Jaringan yang sudah selesai di proses dikeluarkan dan segera dinasukkan ke dalam cetakan blok yang sebelumnya sudah diisi dengan parafin cair hingga mengeras selama ±20 menit.

6) Pemotongan dengan mikrotom

Sebelum dipotong dengan mikrotom, blok didinginkan dengan pemberian batu es selama 15 menit. Blok dijepitkan pada mikrotom kemudian dipotong dengan pisau mikrotom dengna kemiringna 30 terhadap blok parafin setebal 2,5 mikron. Hasil potongan yang berupa pita dimasukkan ke dalam waterbath yang sebelumnya telah diisi dengan air yang dihangatkan sebanyak 50 C, kemudian diambil dengan objek glass dan diberi nomor dengan pensil kaca sesuai nomor registrasi blok, dibiarkan 5 menit, kemudian diinkubasi.

7) Pengecatan/ Staining

a) Deparafinisasi dengan memasukkan preparat xylol I, II, III masing-masing selama 3 menit

b) Rehidrasi dengan memasukkan preparat ke alkohol 100%, 95%, 80%, dan 70% masing-masing selama 2 menit

c) Preparat dimasukkan ke air mengalir selama 3 menit

d) Pengecatan inti dengan memasukkan ke Mayer Hematoksilin selama 7 menit

commit to user

f) Counter stain dengan memasukkan ke larutan Eosin selama 30 detik

g) Dehidrasi dengan memasukkan ke dalam alkohol 70%, 80%, 95%, dan 100% masing-masing 3 celupan

h) Clearing dengan memasukkan ke dalam xylol I dan II masing-masing selama 2 menit.

i) Mounting dengan meneteskan 1 tetes Entelan dan dek glass. c.Pembacaan

a) Pembacaan dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran 10x.

b) Stroma ovarium terdiri dari sel yang berbentuk spindle/fibroblast,berhubungan dengan pematangan folikel

c) Sel terdiri dari lemak cytoplasmik dan dikelilingi serat retikulin,menyerupai miofibrioblastik

d) Pembuluh darah di sekitar stroma ovarium

J. Analisis Data.

Data yang diperoleh (hasil akhir skor histologi) dikumpulkan dan dibandingkan kemaknaannya secara histology/kwalitatif dan kemudian diolah dengan uji Chi Square menggunakan program SPSS versi 17.0 for Windows.

commit to user BAB IV

HASIL DAN ANALISA DATA PENELITIAN

A.Hasil Penelitian

Penelitian dilakukan dengan membandingkan kerusakan stroma ovarium pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan pada hari ke 0, hari ke 5, hari ke 10, dan hari ke 15. Pada hari-hari tersebut, diambil ovarium 5 tikus dari tiap kelompok. Kemudian dilihat adanya kerusakan stroma dari setiap ovarium dengan memeriksa sebanyak 10 lapang pandang pada tiap ovarium. Hasil dari penelitian lengkap dapat dilihat pada lampiran 1. Data yang didapatkan dari penelitian ini kemudian diolah dengan menggunakan program SPSS statistik

versi 17.0 for windows.

Tabel 4.1. Resume hasil pemeriksaan kerusakan stroma ovarium. Hari ke 0 Hari ke 5 Hari ke 10 Hari ke 15

Rusak Tidak

rusak Rusak

Tidak

rusak Rusak

Tidak

rusak Rusak

Tidak rusak

Kontrol 0 10 0 10 0 10 0 10

80 0 10 1 9 2 8 2 8

160 0 10 1 9 2 8 2 8

B. Analisis Data Penelitian

1. Hari ke 0 (sebelum perlakuan)

Ovarium tikus sampel diteliti sebelum diberi perlakuan (hari ke 0) dengan maksud untuk dijadikan sebagai dasar bahwa ovarium tikus yang digunakan dalam keadaan yang baik. Pada penelitian yang dilakukan

commit to user

sebelum tikus diberi perlakuan, didapatkan hasil yang menunjukkan bahwa tidak didapatkan adanya kerusakan stroma ovarium baik pada kelompok kotrol maupun pada kelompok perlakuan, seperti ditunjukkan dalam tabel 4.2 di bawah ini.

Tabel 4.2. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 0.

Kelompok

Kerusakan stroma ovarium

p Ya

n (%)

Tidak n (%)

Total n (%)

Kontrol 0 (0) 10 (100) 10 (100)

1,000 VCD 80 mg/KgBB 0 (0) 10 (100) 10 (100)

VCD 160 mg/KgBB 0 (0) 10 (100) 10 (100)

Tabel di atas menunjukkan bahwa sebelum diberi perlakuan, kedua kelompok tikus tidak terdapat adanya kerusakan stroma ovarium. Sehingga dari hal ini dapat disimpulkan bahwa tidak didapatkan perbedaan antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan.

2. Hari ke 5

Pada hari kelima pemberian VCD dalam dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB, dilakukan pemeriksaan histopatologis ovarium untuk mengetahui adanya kerusakan yang terjadi pada stroma ovarium akibat paparan VCD. Data yang didapatkan pada pemeriksaan pada hari kelima dapat dilihat pada tabel berikut:

commit to user

Tabel 4.3. Hasil uji Chi Kuadrat tentang perbedaan kerusakan stroma ovarium menurut pemberian VCD pada hari ke 5.

Kelompok

Kerusakan stroma ovarium

P Ya

n (%)

Tidak n (%)

Total n (%)

Kontrol 0 (0) 10 (100) 10 (100)

0,585 VCD 80 mg/KgBB 1 (10) 9 (90) 10 (100)

VCD 160 mg/KgBB 1 (10) 9 (90) 10 (100)

Tabel tersebut menunjukkan bahwa pada hari kelima pemberian VCD dengan dosis 80 mg/KgBB dan serta VCD dengan dosis 160 mg/KgBB didapatkan hasil p = 0,585 (p>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa tidak didapatkan adanya perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan 80 mg/KgBB serta kelompok perlakuan 160 mg/KgBB. Dapat pula diartikan bahwa pemberian VCD dengan dosis 80 mg/KgBB dan dosis 160 mg/KgBB selama 5 hari menyebabkan terjadinya kerusakan stroma ovarium, namun secara statistik kerusakan stroma ovarium yang terjadi tidak signifikan.

3. Hari ke 10

Pada hari ke 10 pemberian perlakuan dengan induksi VCD pada tikus dilakukan pula pemeriksaan histopatologis ovarium tikus sampel untuk melihat adanya perubahan pada stroma ovarium sejak diberikannya VCD pada tikus sampel. Data hasil pemeriksaan pada hari ke 10 tersebut ditunjukkan dalam tabel berikut:

commit to user

untuk mengetahui pengaruh VCD terhadap stroma ovarium yang merupakan jaringan penyokong dari folikel ovarium.

Untuk mengetahui pengaruh VCD terhadap stroma ovarium, dilakukan induksi VCD secara peritoneal pada tikus wistar. Tikus dibagi dalam tiga kelompok, yaitu kelompok kontrol (tidak mendapatkan induksi VCD), kelompok 80 mg/KgBB (mendapat pemberian VCD sebanyak 80 mg/KgBB), serta kelompok 160 mg/KgBB (mendapat pemberian VCD sebanyak 160 mg/KgBB).

Kelompok kontrol dalam penelitian ini berfungsi sebagai pembanding serta berfungsi pula untuk mengurangi bias akibat adanya pengaruh dari faktor-faktor luar yang tidak dapat dikendalikan. VCD diberikan dengan suntikan secara intraperitoneal terhadap masing-masing tikus sampel dengan dosis 80 mg/KgBB untuk kelompok 80 mg/KgBB, serta 160 mg/KgBB pada kelompok 160 mg/KgBB. Sedangkan pada kelompok kontrol, disuntikkan cairan sasame oil yang merupakan zat pelarut VCD dalam penelitian ini.

Pemeriksaan stroma ovarium dilakukan pada setiap kelompok sebanyak empat kali, yaitu sebelum pemberian perlakuan, hari ke-5 perlakuan, hari ke-10 perlakuan, serta hari ke-15 perlakuan. Penentuan lama penelitian ini dilakukan berdasarkan pengaruh VCD terhadap ovarium tikus untuk terjadinya Premature Ovarian Failure (POF). Telah diketahui dari penelitian-penelitian yang dilakukan sebelumnya bahwa VCD akan menyebabkan terjadinya kerusakan folikel ovarium dalam pemberian secara intraperitoneal dengan dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB dalam jangka waktu pemberian selama 15 hari. Dalam penelitian ini, peneliti mencoba untuk meneliti tentang pengaruh pemberian VCD secara

commit to user

intaperitoneal dengan dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB yang akan merusak folikel ovarium, apakah juga akan menyebabkan terjadinya kerusakan dari stroma ovarium hewan coba.

Stroma ovarium diperiksa dengan pemeriksaan histopatologis yang dilakukan di laboratorim Patologi Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Pemeriksaan histopatologis yang dilakukan tersebut bertujuan untuk mencari adanya kerusakan stroma ovarium yang disebabkan oleh pemberian VCD pada hewan uji. Kerusakan stroma ovarium yang mungkin terjadi dapat berupa terbentuknya jaringan fibrotik pada stroma ovarium, kekosongan jaringan stroma yang mungkin disebabkan oleh terjadinya vakuolisasi jaringan stroma atau jaringan stroma yang nekrosis, serta terjadinya kerusakan pembuluh darah yang memberikan suplai darah ke folikel ovarium. Setiap ovarium hewan uji diperiksa adakah kerusakan-kerusakan tersebut. Pemeriksaan dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran 10x, serta diperiksa sebanyak 10 lapang pandang untuk setiap ovarium yang diperiksa. 10 lapang pandang yang diperiksa ini dianggap telah mewakili untuk memeriksa seluruh ovarium.

Pada pemeriksaan sebelum diberi perlakuan, tidak didapatkan adanya kerusakan stroma ovarium baik pada kelompok kontrol maupun pada kelompok perlakuan 80 mg/KgBB serta kelompok perlakuan 160 mg/KgBB. Dengan demikian, dari hasil tersebut menunjukkan bahwa kelompok kontrol dan kelompok perlakuan merupakan dua kelompok yang setara sehingga layak untuk digunakan dalam penelitian ini.

commit to user

Pemeriksaan stroma ovarium dilakukan pada hari ke 5 pemberian VCD. Pemeriksaan tersebut dilakukan untuk memeriksa adanya kerusakan stroma ovarium yang disebabkan oleh pemberian VCD dengan dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB. Pada pemeriksaan hari ke 5 tersebut, didapatkan kerusakan stroma ovarium pada kelompok perlakuan 80 mg/KgBB maupun kelompok 160 mg/KgBB masing-masing sebanyak 1 buah kerusakan. Kerusakan yang terjadi adalah sebuah vakuolisasi pada jaringan stroma ovarium. Walaupun kerusakan yang terjadi sangat kecil, namun hal ini tetap dianggap sebagai adanya kerusakan pada ovarium tersebut.

Data yang didapatkan dari pemeriksaan ini kemudian diolah dengan menggunakan program SPSS 17.0 for Windows dan didapatkan hasil berupa nilai p = 0,585 (p>0,05). Data ini menunjukkan bahwa tidak didapatkan perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan pada hari ke 5 pemberian VCD. Sehingga dapat disimpulkan bahwa pada pemberian VCD dengan dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB selama 5 hari tidak menyebabkan terjadinya kerusakan stroma ovarium.

Pada hari ke 10 pemberian VCD dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB, dilakukan kembali pemeriksaan terhadap 5 tikus dari masing-masing kelompok untuk memeriksa adanya kerusakan stroma ovarium. Pada pemeriksaan hari ke 10 ini didapatkan hasil bahwa terdapat kerusakan stroma ovarium berupa vakoulisasi jaringan stroma ovarium sebanyak 2 kerusakan pada kelompok perlakuan 80 mg/KgBB serta terjadi 2 kerusakan stroma ovarium yang juga berupa vakuolisasi dan nekrosis pembuluh darah pada kelompok perlakuan 160 mg/KgBB. Data yang

commit to user

telah didapatkan dari pemeriksaan ini kemudian diolah dengan uji Chi Square dan didapatkan hasil nilai p = 0,315. Hasil uji Chi Square ini menunjukkan bahwa meskipun terdapat adanya kerusakan stroma ovarium pada kelompok perlakuan, namun kerusakan yang terjdai pada pemeriksaan ini masih menunjukkan secara statistik tidak signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan pada hari ke 10 pemberian VCD dosis 80 mg/KgBB dan dosis 160 mg/KgBB.

Pada pemeriksaan yang dilakukan pada hari ke 15, terdapat kerusakan stroma ovarium sebanyak 2 kerusakan dari masing-masing kelompok perlakuan 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB dan hingga hari ke 15 ini, kelompok kontrol tetap tidak didapatkan adanya kerusakan stroma ovarium. Kerusakan yang terjadi ini kemudian diolah dengan uji Chi Square dan didapatkan nilai p = 0,315. Hasil uji ini menunjukkan bahwa meskipun terjadi adanya kerusakan stroma ovarium pada kelompok perlakuan dan tidak didapatkan adanya kerusakan pada kelompok kontrol, namun dari hasil tersebut didapatkan bahwa secara statistik adanya kerusakan stroma ovarium tidak signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan .

Pengolahan data kemudian dilanjutkan dengan menggunakan uji McNemar untuk mengetahui perubahan kerusakan dari hari ke 0 hingga hari ke 15 penelitian. Uji ini dilakukan dengan menbandingkan data hasil penelitian pada hari ke 0 dengan masing-masing data penelitian pada hari ke 5, hari ke 10, dan hari ke 15. Hasil dari uji McNemar ini menunjukkan adanya peningkatan kerusakan stroma ovarium mulai hari ke 5 hingga hari ke 15, dimana pada hari ke 5 nilai p = 0,500, pada hari ke 10 nilai p = 0, 125, dan pada hari ke 15 nilai p =

commit to user

0,125. Pada pengujian dengan menggunakan Chi Square menunjukkan bahwa hasil penelitian tersebut didapatkan terjadinya kerusakan stroma ovarium meskipun kerusakan yang terjadi menunjukkan nilai p yang tidak signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan. Sedangkan pada pengujian dengan menggunakan uji McNemar, terjadi perubahan kerusakan stroma ovarium pada hari ke 5 hingga hari ke 15. Perubahan kerusakanstroma ovarium tersebut menunjukkan nilai p yang tidak signifikan.

Kerusakan yang terjadi pada stroma ovarium akibat pemberian VCD tidak signifikan karena VCD memiliki sasarannya pada folikel preantral dan folikel primer. Sehingga kerusakan yang terjadi pada stroma ovarium tidak sebanyak pada kerusakan yang terjadi pada folikel ovarium.

commit to user

BAB VI

SIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan analisis hasil penelitian dan pembahasannya, maka dapat disimpulkan bahwa pada tikus yang diberikan 4-vinylcyclohexane diepoxide (VCD) secara intraperitoneal dengan dosis 80 mg/KgBB dan 160 mg/KgBB secara klinis dapat menyebabkan terjadinya kerusakan stroma ovarium yang identik dengan proses pada Premature Ovarian Failure (POF), meskipun secara statistik menunjukkan adanya kerusakan stroma ovarium yang tidak signifikan.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek toksisitas VCD terhadap stroma ovarium dengan ukuran sampel dan dosis yang lebih besar.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai terapi Premature Ovarian Failure (POF) melalui stroma ovarium.