UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel.4. Komposisi Formula Simulasi Gummy Vitamin C
Bahan Konsentrasi
Penimbangan Bahan Gummy
Simulasi Sapi
Gummy Simulasi
1 Babi Gummy
Simulasi 25
Babi Gummy
Simulasi 50
Babi Gummy
Simulasi 75
Babi Gummy
Simulasi Babi
Sukrosa 19
0,95 gr 0,95 gr
0,95 gr 0,95 gr
0,95 gr 0,95 gr
Glukosa 18
0,9 gr 0,9 gr
0,9 gr 0,9 gr
0,9 gr 0,9 gr
Gelatin Gelatin Sapi
Gelatin Babi 10
0,5 gr -
0,495 gr 0,005 gr
0,375 gr 0,125 gr
0,25 gr 0.25 gr
0,375 gr 0,125 gr
- 0,5 gr
Asam sitrat 1
0,05 gr 0,05 gr
0,05 gr 0,05 gr
0,05 gr 0,05 gr
Vitamin C 1,5
0,075 gr 0,075 gr
0,075 gr 0,075 gr
0,075 gr 0,075 gr
Tartazine 0,5
0,025 ml 0,025 ml
0,025 ml 0,025 ml
0,025 ml 0,025 ml
Aquadest 50
2,5 ml 2,5 ml
2,5 ml 2,5 ml
2,5 ml 2,5 ml
Total 100
5 gr 5 gr
5 gr 5 gr
5 gr 5 gr
3.4.2. Isolasi DNA
Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan High Pure PCR Template Preparation Kit dari Roche.
1.Preparasi sampel a.
Daging Segar Roche
a
, 2012; Erwanto et al., 2012 Sebanyak 50 mg masing-masing daging sapi dan daging babi
dipotong halus dengan pisau steril. Masing masing daging tersebut dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube. Kemudian ke dalam tube
tersebut masing- masing ditambahkan 200 μl Tissue Lysis Buffer dan 40
μl larutan Proteinase K. Campuran divortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama 24 jam dalam waterbath.
b.Gelatin dan Sampel Simulasi Gummy Vitamin C Roche
a
, 2012; Erwanto et al., 2012;Sambrook et al, 2001 dengan modifikasi
Sebanyak 500 mg masing-masing gelatin sapi, gelatin babi dan sampel simulasi gummy vitamin C dimasukkan ke dalam
microtube,sampel simulasi gummy vitamin C dileburkan diatas penangas
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dengan suhu 60ºC. Kemudian ditambahkan 500 µ L natrium asetat 3M dan 500 µ L isopropanol equal volume. Sampel dikocok dengan
membalikkan tube tiga kali hingga homogen. 2.
Proses isolasi DNA Roche
a
, 2012; Erwanto et al., 2012 Sebanyak 600 µ L sampel yang diambil dari campuran natrium asetat dan
isopropanol dilarutkan dalam 200 uL Tissue Lysis Buffer dan 40 uL proteinase K kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C selama 24 jam.
Setelah sampel melebur, ditambahkan 200 uL binding buffer divortex selama 2 menit lalu diinkubasi pada suhu 70 °C selama 10 menit. Lalu
ditambahkan 2 00 μl isopropanol dan dihomogenkan dengan vortex
selama 2 menit. Campuran sampel dipipet ke atas High Pure Filter Tube yang telah dipasangkan Collection Tube, kemudian tube ditutup dan
dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter
dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube
yang baru. Ditambahkan 500 μl Inhibitor Removal Buffer melalui penyangga atas Filter Tube dan disentrifugasi
kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang
bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube
yang baru. Ditambahkan 500 μl Wash Buffer kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter
tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali
dengan collection tube yang baru. Ditambahkan 500 μl Wash Buffer
kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang
melewati filter dibuang. Filter tube dipasang kembali dengan collection tube dan dilakukan sentrifugasi selama 10 detik dengan kecepatan
maksimum. Hal ini dilakukan agar semua wash buffer tidak tertinggal pada filter. Collection tube dilepaskan dari Filter tube dan dibuang.
Untuk mengelusi DNA yang terdapat pada filter, pasang Filter tube
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
tersebut pada 1.5 ml Microsentrifuge tube yang bersih dan steril. Elution Bufffer dihangatkan dengan Penangas Air pada suhu ±70
o
C terlebih dahulu. Kemudian ditambahkan 150
μl Elution Buffer yang telah dihangatkan sebelumnya dan penambahan elution buffer dibagi menjadi
tiga kali dengan volume 50 uL. Sentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Filter tube dilepaskan. Pada
Microsentrifuge tube telah mengandung DNA terpurifikasi yang dapat disimpan pada suhu 2
o
C, 8
o
C, 15
o
C, dan 25
o
C untuk dianalisa selanjutnya.
3.4.3.Pengujian Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan
Spektrofotometer DNA
Alat spektrofotometer Biodrop dinyalakan, bagian ‘’nucleic
acid’’ditekan. Dipilih pathlength 0.5mm. Pedestal dibersihkan terlebih dahulu dengan tissu kemudian dipipet sebanyak 1
μL blanko elution buffer dan diteteskan pada pedestal. Bagian
‘’BLANK’’pada layar ditekan untuk pengukuran blanko, setelah selesai pedestal dibersihkan dengan tissue.
Larutan isolat DNA sebanyak 1 μL dipipet dan dimasukkan ke dalam
pedestal, kemudian klik tombol ‘’ Measure’’ sehingga layar akan
menampilkan spektrum dan jumlah konsentrasi yang dihitung Biodrop, 2012.
3.4.4.Amplifikasi Real-Time PCR
Proses yang dilakukan pada amplifikasi DNA dengan Real Time PCR adalah sebagai berikut:
Larutan induk primer dan probe dengan konsentrasi 100 μM dibuat dan dimasukkan ke dalam tube.Primer dan probe konsentrasi 10 μM yang
dibuat dari larutan induk 100 μM dan disimpan ke dalam tube yang lain.
Kemudian Master Mix dibuat dengan volume total 20 μL yang terdiri dari 5
μL template DNA, 1.4 μL Aquabidest, 1.6 μL primer forward konsentrasi 0,8 μM, 1.6 μL primer reverse konsentrasi 0,8 μM, 0.4 μL probe konsentrasi
0,2 μM, dan 10 μL LightCycler® 480 probe master enzim FastStart Taq
DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6.4 mM MgCl
2
. Masing-masing DNA template dimasukkan ke well terlebih dahulu kemudian master mix
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan dan ditutup dengan sealing foil. Dilakukan proses pengaturan program LightCycler® 480
Real-Time PCR yang akan digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah campuran reaksi total PCR dan program amplifikasi telah siap, campuran
reaksi total PCR diletakkan pada multiwell plate yang ditutup menggunakan sealing foil, kemudian diletakkan pada mesin real-time PCR. Instrumen
Real-Time PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung memberikan hasil amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva Roche
c
, 2008.
Gambar.8. Program Amplifikasi Real-Time PCR
Sumber : Roche
c
,2008
30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Pembuatan Simulasi Gummy Vitamin C
