UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan di amplifikasi secara eksponensial disebut amplikon
yang berupa untai ganda, sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan 2nx. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah
jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2
siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara
eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu
nukleotida A pada ujung 3’ dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor
yang ditambahkan nukleotida T pada ujung- ujung 5’-nya. Proses PCR
dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler Ghaffar, 2007.
2.7. Real-Time PCR
Real-time PCR adalah suatu metode untuk mendeteksi dan penghitungan sinyal fluoresensi sebanding dengan dihasilkannya produk
PCR setiap siklus amplifikasi PCR Dennis Lo et al., 2006. Kuantifikasi level ekspresi gen dapat menghasilkan petunjuk tentang fungsi gen, sebagai
contoh yaitu pengukuran ekspresi gen dapat membantu mengidentifikasi jenis sel atau jaringan dimana gen tersebut diekspresikan, selain itu juga
menunjukkan tingkat ekspresi gen keadaan biologis individu seperti jenis penyakit yang terdapat pada individu tersebut Fraga et al., 2008.
Penggunaan Real-time PCR memiliki beberapa keunggulan yaitu mampu menganalisis sampel dengan jumlah relatif sedikit, memiliki kemampuan
untuk menghasilkan data cepat dan akurat, dan mampu menganalisis lebih dari satu gen dalam satu waktu Fraga et al., 2008.
Dalam penggunaan alat real-time PCR memiliki dua jenis komponen bahan kimia untuk mendeteksi sampel selama siklus PCR yaitu
pewarna fluoresensi SYBR green dan probe DNA. Pewarna berfluoresensi
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
menginterkalasi DNA beruntai ganda, sedangkan probe DNA terdiri dari oligonuklotida yang dihubungkan dengan pewarna fluoresensi dan quencher.
Pada proses pendegradasian melepaskan pewarna fluoresensi dari komponen yang berfungsi untuk pendegradasi sehingga menghasilkan emisi fluoresensi
yang sebanding dengan jumlah template DNA. Sinyal fluoresensi yang terbentuk diukur dan digunakan untuk kuantisasi DNA Hui Chai et al.,
2011. Instrumen real-time PCR mendeteksi amplikon dan mengukur
peningkatan fluoresensi yang dihasilkan dari sintesis DNA. Fluoresensi ini dihasilkan ketika terjadi peningkatan ikatan double strand DNA dengan
pewarna atau probe fluorogenic pada pencampuran amplifikasi. Peningkatan fluoresensi digambarkan dengan kurva yang terdiri dari tiga buah fasa yaitu
fasa awal atau fasa inisiasi yaitu fase terjadi pada siklus pertama PCR dimana pancaran fluoresensi belum dapat dibedakan dari baseline, fasa eksponensial
atau fasa puncak merupakan fase peningkatan eksponensial dalam fluoresensi sebelum fase plateau tercapai, dan fasa plateau atau fasa stabil
yaitu tidak terjadi peningkatan fluoresensi yang diamati Vaerman, 2004; Rodriguez, 2013.
Instrumen Real-time PCR memiliki tiga komponen utama yaitu thermal block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi
data, dan software sebagai analisa data. Real-time PCR dapat menganalisa banyak sampel hingga 96 sampel menggunakan multiwell plates Roche
c
, 2008.
Gambar 7. Bentuk Kurva Real- Time PCR
Sumber :Rodriguez, 2013
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat
