24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Halal Food and Drug Analysis, Laboratorium Penelitian II, dan Laboratorium MPR Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta. Waktu pelaksanaan dari bulan Januari 2014 hingga
Desember 2014.
3.2. Alat dan Bahan
3.2.1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pisau steril, mikropipet ukuran 10
μL, 200 μL, 1000 μL [BIO RAD], tips 10 μL, 100 μL, 1000 μL, tube dan mikro tube, high pure filtrationn tube [Roche],
collection tube [Roche], Spektrofotometer Nano Drop [BioDrop], dan mesin real-time PCR [LightCycler® 480.0-Roche]. Alat gelas yang digunakan
adalah gelas ukur, gelas beaker [Pyrex], batang pengaduk dan cawan
penguap. 3.2.2.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging sapi, daging babi, standar gelatin babi dan gelatin sapi pro analisa [Sigma
Aldrich], sukrosa, sirup glukosa, asam sitrat, tartrazine [Sigma Aldrich], aquadest, aquabidest, gelatin sapi teknis [EMS], Natrium Asetat 3M
[Merck], Isopropanol [Merck] satu set High Pure PCR Template Preparation Kit
®
Roche meliputi: Tissue Lysis Buffer, Binding Buffer, Proteinase K, Inhibitor Removal Buffer, Wash Buffer, dan Elution
Buffer,etanol absolut [Merck],isopropanol [Merck], ddH
2
O [Roche], LC TaqMan Probe Master [Roche] yang terdiri: FastStart Taq DNA
Polymerase, buffer, dNTP mix, MgCl
2
6,4 mM. Dan primer-probe seperti pada tabel berikut.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel. 3. Susunan basa primer dan probe untuk DNA sapi dan babi Sumber : Tanabe et al., 2007 dengan modifikasi
Babi Forward Reverse
Probe 5-ATCTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3
5-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3 5-FAM-CACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTAC-BHQ1-3
Sapi Forward
Reverse Probe
5-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3 5-AATGGGATTTTGCTACGTCTGAGG-3
5-FAM-CCACCTACTATTCCTCCACGAAACA-BHQ1-3 3.3.
Tahapan Penelitian
1. Pembuatan Gummy Simulasi Vitamin C Dari Gelatin Babi Dan Gelatin
Sapi 2.
Isolasi DNA dari Daging, Gelatin, dan Gummy Simulasi 3.
Analisis Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan Spektrofotometri DNA
4. Amplifikasi Isolat DNA dengan Real-Time PCR
5. Analisis Hasil Amplifikasi
3.4. Prosedur Kerja
3.4.1.Pembuatan Simulasi Gummy Vitamin C dari Gelatin Babi dan Gelatin
Sapi
Sebanyak 0,95 gr sukrosa, 0,9 gr glukosa dan 0,05 gr asam sitrat dilarutkan dengan 1,4 mL aquadest diatas penangas air pada suhu 65 ºC
larutan A. Pada wadah lain 0,5 gr gelatin dilarutkan dengan 1 mL aquadest di atas penangas air dengan suhu 60º C Larutan B. Sebanyak 0,075 gr
vitamin C dilarutkan dengan 0,1 ml aquadest diaduk hingga melarut Larutan C. Kemudian larutan A dan larutan C dicampur pada larutan B, diaduk
hingga homogen. Sebanyak 0,025 ml tartrazine dicampurkan ke larutan B diaduk hingga terlihat warna yang homogen. Massa yang terbentuk disimpan
di dalam refigrator selama 24 jam. Untuk pembuatan sampel simulasi gummy dengan berbagai presentase campuran babi sama perlakuan dengan prosedur
di atas Schrieber and Gareis, 2007 dengan modifikasi.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel.4. Komposisi Formula Simulasi Gummy Vitamin C
Bahan Konsentrasi
Penimbangan Bahan Gummy
Simulasi Sapi
Gummy Simulasi
1 Babi Gummy
Simulasi 25
Babi Gummy
Simulasi 50
Babi Gummy
Simulasi 75
Babi Gummy
Simulasi Babi
Sukrosa 19
0,95 gr 0,95 gr
0,95 gr 0,95 gr
0,95 gr 0,95 gr
Glukosa 18
0,9 gr 0,9 gr
0,9 gr 0,9 gr
0,9 gr 0,9 gr
Gelatin Gelatin Sapi
Gelatin Babi 10
0,5 gr -
0,495 gr 0,005 gr
0,375 gr 0,125 gr
0,25 gr 0.25 gr
0,375 gr 0,125 gr
- 0,5 gr
Asam sitrat 1
0,05 gr 0,05 gr
0,05 gr 0,05 gr
0,05 gr 0,05 gr
Vitamin C 1,5
0,075 gr 0,075 gr
0,075 gr 0,075 gr
0,075 gr 0,075 gr
Tartazine 0,5
0,025 ml 0,025 ml
0,025 ml 0,025 ml
0,025 ml 0,025 ml
Aquadest 50
2,5 ml 2,5 ml
2,5 ml 2,5 ml
2,5 ml 2,5 ml
Total 100
5 gr 5 gr
5 gr 5 gr
5 gr 5 gr
3.4.2. Isolasi DNA
Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan High Pure PCR Template Preparation Kit dari Roche.
1.Preparasi sampel a.
Daging Segar Roche
a
, 2012; Erwanto et al., 2012 Sebanyak 50 mg masing-masing daging sapi dan daging babi
dipotong halus dengan pisau steril. Masing masing daging tersebut dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube. Kemudian ke dalam tube
tersebut masing- masing ditambahkan 200 μl Tissue Lysis Buffer dan 40
μl larutan Proteinase K. Campuran divortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama 24 jam dalam waterbath.
b.Gelatin dan Sampel Simulasi Gummy Vitamin C Roche
a
, 2012; Erwanto et al., 2012;Sambrook et al, 2001 dengan modifikasi
Sebanyak 500 mg masing-masing gelatin sapi, gelatin babi dan sampel simulasi gummy vitamin C dimasukkan ke dalam
microtube,sampel simulasi gummy vitamin C dileburkan diatas penangas
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dengan suhu 60ºC. Kemudian ditambahkan 500 µ L natrium asetat 3M dan 500 µ L isopropanol equal volume. Sampel dikocok dengan
membalikkan tube tiga kali hingga homogen. 2.
Proses isolasi DNA Roche
a
, 2012; Erwanto et al., 2012 Sebanyak 600 µ L sampel yang diambil dari campuran natrium asetat dan
isopropanol dilarutkan dalam 200 uL Tissue Lysis Buffer dan 40 uL proteinase K kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C selama 24 jam.
Setelah sampel melebur, ditambahkan 200 uL binding buffer divortex selama 2 menit lalu diinkubasi pada suhu 70 °C selama 10 menit. Lalu
ditambahkan 2 00 μl isopropanol dan dihomogenkan dengan vortex
selama 2 menit. Campuran sampel dipipet ke atas High Pure Filter Tube yang telah dipasangkan Collection Tube, kemudian tube ditutup dan
dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter
dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube
yang baru. Ditambahkan 500 μl Inhibitor Removal Buffer melalui penyangga atas Filter Tube dan disentrifugasi
kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang
bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube
yang baru. Ditambahkan 500 μl Wash Buffer kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter
tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali
dengan collection tube yang baru. Ditambahkan 500 μl Wash Buffer
kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang
melewati filter dibuang. Filter tube dipasang kembali dengan collection tube dan dilakukan sentrifugasi selama 10 detik dengan kecepatan
maksimum. Hal ini dilakukan agar semua wash buffer tidak tertinggal pada filter. Collection tube dilepaskan dari Filter tube dan dibuang.
Untuk mengelusi DNA yang terdapat pada filter, pasang Filter tube
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
tersebut pada 1.5 ml Microsentrifuge tube yang bersih dan steril. Elution Bufffer dihangatkan dengan Penangas Air pada suhu ±70
o
C terlebih dahulu. Kemudian ditambahkan 150
μl Elution Buffer yang telah dihangatkan sebelumnya dan penambahan elution buffer dibagi menjadi
tiga kali dengan volume 50 uL. Sentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Filter tube dilepaskan. Pada
Microsentrifuge tube telah mengandung DNA terpurifikasi yang dapat disimpan pada suhu 2
o
C, 8
o
C, 15
o
C, dan 25
o
C untuk dianalisa selanjutnya.
3.4.3.Pengujian Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan
Spektrofotometer DNA
Alat spektrofotometer Biodrop dinyalakan, bagian ‘’nucleic
acid’’ditekan. Dipilih pathlength 0.5mm. Pedestal dibersihkan terlebih dahulu dengan tissu kemudian dipipet sebanyak 1
μL blanko elution buffer dan diteteskan pada pedestal. Bagian
‘’BLANK’’pada layar ditekan untuk pengukuran blanko, setelah selesai pedestal dibersihkan dengan tissue.
Larutan isolat DNA sebanyak 1 μL dipipet dan dimasukkan ke dalam
pedestal, kemudian klik tombol ‘’ Measure’’ sehingga layar akan
menampilkan spektrum dan jumlah konsentrasi yang dihitung Biodrop, 2012.
3.4.4.Amplifikasi Real-Time PCR
Proses yang dilakukan pada amplifikasi DNA dengan Real Time PCR adalah sebagai berikut:
Larutan induk primer dan probe dengan konsentrasi 100 μM dibuat dan dimasukkan ke dalam tube.Primer dan probe konsentrasi 10 μM yang
dibuat dari larutan induk 100 μM dan disimpan ke dalam tube yang lain.
Kemudian Master Mix dibuat dengan volume total 20 μL yang terdiri dari 5
μL template DNA, 1.4 μL Aquabidest, 1.6 μL primer forward konsentrasi 0,8 μM, 1.6 μL primer reverse konsentrasi 0,8 μM, 0.4 μL probe konsentrasi
0,2 μM, dan 10 μL LightCycler® 480 probe master enzim FastStart Taq
DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6.4 mM MgCl
2
. Masing-masing DNA template dimasukkan ke well terlebih dahulu kemudian master mix
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan dan ditutup dengan sealing foil. Dilakukan proses pengaturan program LightCycler® 480
Real-Time PCR yang akan digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah campuran reaksi total PCR dan program amplifikasi telah siap, campuran
reaksi total PCR diletakkan pada multiwell plate yang ditutup menggunakan sealing foil, kemudian diletakkan pada mesin real-time PCR. Instrumen
Real-Time PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung memberikan hasil amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva Roche
c
, 2008.
Gambar.8. Program Amplifikasi Real-Time PCR
Sumber : Roche
c
,2008
30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Pembuatan Simulasi Gummy Vitamin C
Gambar 9. Simulasi gummy vitamin C Pada penelitian ini dilakukan pembuatan simulasi gummy vitamin C
yang terdiri dari simulasi gummy vitamin C sapi, simulasi gummy vitamin C babi, serta simulasi gummy vitamin C campuran sapi dan babi dengan
persentase 1 babi, 25 babi, 50 babi, dan 75 babi. Formulasi simulasi
gummy vitamin c yang digunakan adalah sukrosa dan glukosa sebagai pemanis, gelatin sebagai basis gummy, asam sitrat sebagai agen pengasam
dan tartrazin sebagai pewarna. Formulasi gummy simulasi vitamin C merupakan modifikasi dari formulasi gummy yang terdapat pada Gelatine
Handbook : Theory and Industrial Practice Schriber Gareis, 2007. Simulasi Gummy vitamin C yang dihasilkan pada penelitian ini
memiliki sifat organoleptis yaitu berwarna oranye, memiliki rasa asam, kenyal, dan meleleh dalam mulut saat dikunyah. Berat sediaan gummy rata-
rata 3,8 gr. Berat sediaan tersebut masih belum memenuhi standar berat sebenarnya yaitu 5 gr. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh beberapa hal
diantaranya sisa larutan gummy masih ada yang menempel pada dinding cawan sehingga tidak tertuang keseluruhan.
4.2. Isolasi DNA
Proses isolasi DNA merupakan tahap awal sebelum dilakukannya analisis sumber DNA pada sediaan gummy simulasi vitamin C. Isolasi DNA
dilakukan untuk mendapatkan DNA genom dari daging sapi, daging babi,
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
gelatin sapi, gelatin babi, simulasi gummy vitamin C sapi, simulasi gummy vitamin C babi, serta simulasi gummy vitamin C campuran sapi dan babi
dengan berbagai konsentrasi. Ada tiga tahap umum dalam proses isolasi DNA yaitu perusakan dinding sel lisis, pemisahan DNA dari bahan padat
seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA Ardiana, 2009. Pada penelitian ini isolasi DNA dilakukan dengan metode ekstraksi fase solid
menggunakan matriks silika dari kit komersial High Pure PCR Template Preparation Roche. Alasan pemilihan metode ekstraksi dengan kit
komersial ini dibandingkan dengan metode konvensial dikarenakan metode konvensional membutuhkan proses yang lama, jumlah sampel yang cukup
banyak dalam mengekstraksi serta jumlah reagen yang begitu besar. Kit komersial yang digunakan pada penelitian ini menggunakan teknologi filter
matriks silika untuk mengisolasi DNA dari sampel. Prinsipnya yaitu asam nukleat akan teradsorbsi oleh matriks silika pada filter dengan adanya garam
chaotropic seperti natrium asetat, guanidin tiosianat atau guanidin hidroklorida. Adsorbsi asam nukleat dengan matriks silika disebabkan
adanya afinitas tinggi antara rantai asam nukleat yang bermuatan negatif terhadap partikel silika bermuatan positif. Kekuatan adsorbsi silika terhadap
asam nukleat bergantung pada kekuatan ion dan pH lingkungan. Asam nukleat yang teradsorbsi oleh silika akan mudah dibersihkan dari pengotor
lainnya dibawah tekanan gaya sentrifugal. Asam nukleat yang teradsorbsi pada matriks silika dapat dielusi dengan menambahkan larutan rendah
garam Tan C,S Yiap CB.,2009; Jaiprakash, 2014; Chacon Griffiths, 2014. Pada penelitian ini dilakukan beberapa modifikasi diantaranya pada
berat sampel yang digunakan, penambahan volume pereaksi, kecepatan sentrifugasi, lama inkubasi, dan urutan langkah kerja.
Sebelum memulai proses isolasi, DNA sampel dipresipitasi terlebih dahulu menggunakan isopropanol dan garam natrium asetat dengan volume
yang sama. Adanya isopropanol dapat mengurangi kelarutan DNA pada air serta adanya garam natrium asetat berfungsi untuk mengikatkan muatan
negatif pada gugus fosfat DNA dengan kation natrium asetat Greene, 1998. Langkah selanjutnya dalam isolasi DNA ini sampel dilisiskan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
terlebih dahulu dengan 200 µ L tissue lysis buffer. Larutan tissue lysis buffer mengandung EDTA yang merupakan
zat yang mengikat ion magnesium pada dinding sel sehingga memudahkan proses pelisisan dinding sel
Sudjadi, 2008. Urea 4M merupakan zat kaotropik yang mendenaturasi protein pada sel. Tris 200 mM sebagai buffer yang menjaga kestabilan pH
DNA efektif pada pH 7-9 Tan Alex, 2014. Langkah selanjutnya sampel ditambahkan proteinase K lalu
diinkubasi pada suhu 55ºC selama 24 jam. Proteinase K berfungsi sebagai pendegradasi protein yang terikat pada DNA. Proses degradasi protein
diperlukan kondisi yang optimal pada suhu 50-55º C dengan pH 7.5 sampai 8 Kieleczawa, 2006.
Selanjutnya ditambahkan 200 µ L binding buffer diinkubasi 10 menit pada suhu 70 ºC dan ditambahkan 250 µ L isopropanol untuk mengikat
DNA pada membran. Larutan sampel kemudian dimasukkan pada filter tube yang telah terpasang pada collection tube kemudian disentrifugasi. Filter
tube yang telah digunakan sebelumnya, dipasangkan collection tube baru dan ditambahkan inhibitor removal buffer.Tujuan dari penambahan
inhibitor removal buffer ini adalah untuk menghilangkan zat-zat pengotor seperti protein yang menghambat pada amplifikasi PCR. Filter tube
kemudian dipasangkan dengan collection tube baru dan ditambahkan wash buffer. Larutan wash buffer berfungsi menghilangkan sisa kotoran protein
dan garam kaotropik yang terikat pada DNA. Setelah dilakukan pencucian, DNA yang terikat pada matriks silika kemudian dielusi dengan Elution
Buffer yang telah dipanaskan pada suhu 70 °C, tujuan pemanasan untuk pengelusian isolat DNA secara optimal. Roche, 2012; Kennedy, 2010.
Isolat DNA kemudian dianalisis konsentrasi dan kemurniannya dengan spektrofotometer DNA.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4.3.
Analisa Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA
Tabel .5. Konsentrasi dan kemurnian Isolat DNA
Analisa konsentrasi dan kemurnian DNA dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer DNA. Prinsip kerja spektrofotometer DNA
sesuai dengan spektrofotometer UV tetapi pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemurnian isolat DNA dilihat
dengan rasio A260A280 adalah 1,8-2 Sambrook et al, 2001 ; Sudjadi, 2008;Conn, 2012.
Konsentrasi DNA yang didapatkan pada daging sapi sebesar 36,45 ngµ L dan daging babi sebesar 46 ngµ L. Sedangkan gelatin
sapi sebesar 29,44 ngµ L, gelatin babi sebesar 10,36 ngµ L, serta gummy 1 babi sebesar13,85 ngµ L, gummy 25 babi sebesar 10,23ngµ L,
gummy 50 babi sebesar 12,06 ngµ L, dan gummy 75 babi sebesar 30,13 ngµ L. Konsentrasi isolat DNA daging yang didapatkan jauh lebih besar
dibandingkan DNA gelatin dan DNA sampel gummy. Hal ini dikarenakan pada daging memiliki jumlah sel yang banyak dan belum mengalami proses
pengolahan sedangkan gelatin merupakan produk hasil hidrolisis dari kolagen yang menyebabkan denaturasi DNA sehingga DNA yang
NO SAMPEL
KONSENTRASI
ngµL
KEMURNIAN A260A280
1 Daging sapi
36,54 1,923
2 Daging babi
46 1,804
3 Gelatin sapi
29,44 1,597
4 Gelatin babi
10,36 1,610
5 Gummy sapi
17,18 1,606
6 Gummy babi
18 1,645
7 Gummy campuran babi 1
13,85 1,565
8 Gummy campuran babi 25
10,23 1,588
9 Gummy campuran babi 50
12,06 1,504
10 Gummy campuran babi 75
30,13 1,638
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
didapatkan sedikit. Kemurnian DNA daging kisaran 1,9-1,8. Sedangkan kemurnian gelatin berada pada kisaran 1,6-1,5. Sampel gummy vitamin C
memiliki kemurnian pada kisaran 1,5-1,6. Nilai kemurnian DNA pada daging termasuk dalam kategori murni karena memenuhi rasio antara 1,8-
2,0. Adapun nilai kemurnian DNA pada gelatin maupun sampel simulasi gummy vitamin C termasuk dalam kategori belum murni, karena nilai
kemurnian dibawah 1,8. Nilai kemurnian DNA pada sampel gelatin sapi, gelatin babi, dan simulasi gummy vitamin C rendah disebabkan terdapat
kontaminan protein dimana nilai kemurnian 1,5 memiliki perbandingan persentase protein dan asam nukleat yaitu sekitar 80 dan 20 selain hal
tersebut sebanyak 92 komposisi gelatin adalah protein maka dari itu dengan presentase protein yang besar memungkinkan terdapat sisa protein
yang tertinggal dalam isolat DNA Sambrook et al, 2001; Schrieber, 2007.
4.4. Amplifikasi DNA Daging, Gelatin, dan Sampel Simulasi Gummy