Waktu dan Tempat Pembuatan Simulasi Gummy Vitamin C Isolasi DNA

24 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Halal Food and Drug Analysis, Laboratorium Penelitian II, dan Laboratorium MPR Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta. Waktu pelaksanaan dari bulan Januari 2014 hingga Desember 2014.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pisau steril, mikropipet ukuran 10 μL, 200 μL, 1000 μL [BIO RAD], tips 10 μL, 100 μL, 1000 μL, tube dan mikro tube, high pure filtrationn tube [Roche], collection tube [Roche], Spektrofotometer Nano Drop [BioDrop], dan mesin real-time PCR [LightCycler® 480.0-Roche]. Alat gelas yang digunakan adalah gelas ukur, gelas beaker [Pyrex], batang pengaduk dan cawan penguap. 3.2.2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging sapi, daging babi, standar gelatin babi dan gelatin sapi pro analisa [Sigma Aldrich], sukrosa, sirup glukosa, asam sitrat, tartrazine [Sigma Aldrich], aquadest, aquabidest, gelatin sapi teknis [EMS], Natrium Asetat 3M [Merck], Isopropanol [Merck] satu set High Pure PCR Template Preparation Kit ® Roche meliputi: Tissue Lysis Buffer, Binding Buffer, Proteinase K, Inhibitor Removal Buffer, Wash Buffer, dan Elution Buffer,etanol absolut [Merck],isopropanol [Merck], ddH 2 O [Roche], LC TaqMan Probe Master [Roche] yang terdiri: FastStart Taq DNA Polymerase, buffer, dNTP mix, MgCl 2 6,4 mM. Dan primer-probe seperti pada tabel berikut. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel. 3. Susunan basa primer dan probe untuk DNA sapi dan babi Sumber : Tanabe et al., 2007 dengan modifikasi Babi Forward Reverse Probe 5-ATCTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3 5-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3 5-FAM-CACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTAC-BHQ1-3 Sapi Forward Reverse Probe 5-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3 5-AATGGGATTTTGCTACGTCTGAGG-3 5-FAM-CCACCTACTATTCCTCCACGAAACA-BHQ1-3 3.3. Tahapan Penelitian 1. Pembuatan Gummy Simulasi Vitamin C Dari Gelatin Babi Dan Gelatin Sapi 2. Isolasi DNA dari Daging, Gelatin, dan Gummy Simulasi 3. Analisis Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan Spektrofotometri DNA 4. Amplifikasi Isolat DNA dengan Real-Time PCR 5. Analisis Hasil Amplifikasi

3.4. Prosedur Kerja

3.4.1.Pembuatan Simulasi Gummy Vitamin C dari Gelatin Babi dan Gelatin Sapi Sebanyak 0,95 gr sukrosa, 0,9 gr glukosa dan 0,05 gr asam sitrat dilarutkan dengan 1,4 mL aquadest diatas penangas air pada suhu 65 ºC larutan A. Pada wadah lain 0,5 gr gelatin dilarutkan dengan 1 mL aquadest di atas penangas air dengan suhu 60º C Larutan B. Sebanyak 0,075 gr vitamin C dilarutkan dengan 0,1 ml aquadest diaduk hingga melarut Larutan C. Kemudian larutan A dan larutan C dicampur pada larutan B, diaduk hingga homogen. Sebanyak 0,025 ml tartrazine dicampurkan ke larutan B diaduk hingga terlihat warna yang homogen. Massa yang terbentuk disimpan di dalam refigrator selama 24 jam. Untuk pembuatan sampel simulasi gummy dengan berbagai presentase campuran babi sama perlakuan dengan prosedur di atas Schrieber and Gareis, 2007 dengan modifikasi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel.4. Komposisi Formula Simulasi Gummy Vitamin C Bahan Konsentrasi Penimbangan Bahan Gummy Simulasi Sapi Gummy Simulasi 1 Babi Gummy Simulasi 25 Babi Gummy Simulasi 50 Babi Gummy Simulasi 75 Babi Gummy Simulasi Babi Sukrosa 19 0,95 gr 0,95 gr 0,95 gr 0,95 gr 0,95 gr 0,95 gr Glukosa 18 0,9 gr 0,9 gr 0,9 gr 0,9 gr 0,9 gr 0,9 gr Gelatin Gelatin Sapi Gelatin Babi 10 0,5 gr - 0,495 gr 0,005 gr 0,375 gr 0,125 gr 0,25 gr 0.25 gr 0,375 gr 0,125 gr - 0,5 gr Asam sitrat 1 0,05 gr 0,05 gr 0,05 gr 0,05 gr 0,05 gr 0,05 gr Vitamin C 1,5 0,075 gr 0,075 gr 0,075 gr 0,075 gr 0,075 gr 0,075 gr Tartazine 0,5 0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml Aquadest 50 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml Total 100 5 gr 5 gr 5 gr 5 gr 5 gr 5 gr

3.4.2. Isolasi DNA

Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan High Pure PCR Template Preparation Kit dari Roche. 1.Preparasi sampel a. Daging Segar Roche a , 2012; Erwanto et al., 2012 Sebanyak 50 mg masing-masing daging sapi dan daging babi dipotong halus dengan pisau steril. Masing masing daging tersebut dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube. Kemudian ke dalam tube tersebut masing- masing ditambahkan 200 μl Tissue Lysis Buffer dan 40 μl larutan Proteinase K. Campuran divortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama 24 jam dalam waterbath. b.Gelatin dan Sampel Simulasi Gummy Vitamin C Roche a , 2012; Erwanto et al., 2012;Sambrook et al, 2001 dengan modifikasi Sebanyak 500 mg masing-masing gelatin sapi, gelatin babi dan sampel simulasi gummy vitamin C dimasukkan ke dalam microtube,sampel simulasi gummy vitamin C dileburkan diatas penangas UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dengan suhu 60ºC. Kemudian ditambahkan 500 µ L natrium asetat 3M dan 500 µ L isopropanol equal volume. Sampel dikocok dengan membalikkan tube tiga kali hingga homogen. 2. Proses isolasi DNA Roche a , 2012; Erwanto et al., 2012 Sebanyak 600 µ L sampel yang diambil dari campuran natrium asetat dan isopropanol dilarutkan dalam 200 uL Tissue Lysis Buffer dan 40 uL proteinase K kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C selama 24 jam. Setelah sampel melebur, ditambahkan 200 uL binding buffer divortex selama 2 menit lalu diinkubasi pada suhu 70 °C selama 10 menit. Lalu ditambahkan 2 00 μl isopropanol dan dihomogenkan dengan vortex selama 2 menit. Campuran sampel dipipet ke atas High Pure Filter Tube yang telah dipasangkan Collection Tube, kemudian tube ditutup dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Ditambahkan 500 μl Inhibitor Removal Buffer melalui penyangga atas Filter Tube dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Ditambahkan 500 μl Wash Buffer kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Ditambahkan 500 μl Wash Buffer kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang. Filter tube dipasang kembali dengan collection tube dan dilakukan sentrifugasi selama 10 detik dengan kecepatan maksimum. Hal ini dilakukan agar semua wash buffer tidak tertinggal pada filter. Collection tube dilepaskan dari Filter tube dan dibuang. Untuk mengelusi DNA yang terdapat pada filter, pasang Filter tube UIN Syarif Hidayatullah Jakarta tersebut pada 1.5 ml Microsentrifuge tube yang bersih dan steril. Elution Bufffer dihangatkan dengan Penangas Air pada suhu ±70 o C terlebih dahulu. Kemudian ditambahkan 150 μl Elution Buffer yang telah dihangatkan sebelumnya dan penambahan elution buffer dibagi menjadi tiga kali dengan volume 50 uL. Sentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Filter tube dilepaskan. Pada Microsentrifuge tube telah mengandung DNA terpurifikasi yang dapat disimpan pada suhu 2 o C, 8 o C, 15 o C, dan 25 o C untuk dianalisa selanjutnya. 3.4.3.Pengujian Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA Alat spektrofotometer Biodrop dinyalakan, bagian ‘’nucleic acid’’ditekan. Dipilih pathlength 0.5mm. Pedestal dibersihkan terlebih dahulu dengan tissu kemudian dipipet sebanyak 1 μL blanko elution buffer dan diteteskan pada pedestal. Bagian ‘’BLANK’’pada layar ditekan untuk pengukuran blanko, setelah selesai pedestal dibersihkan dengan tissue. Larutan isolat DNA sebanyak 1 μL dipipet dan dimasukkan ke dalam pedestal, kemudian klik tombol ‘’ Measure’’ sehingga layar akan menampilkan spektrum dan jumlah konsentrasi yang dihitung Biodrop, 2012. 3.4.4.Amplifikasi Real-Time PCR Proses yang dilakukan pada amplifikasi DNA dengan Real Time PCR adalah sebagai berikut: Larutan induk primer dan probe dengan konsentrasi 100 μM dibuat dan dimasukkan ke dalam tube.Primer dan probe konsentrasi 10 μM yang dibuat dari larutan induk 100 μM dan disimpan ke dalam tube yang lain. Kemudian Master Mix dibuat dengan volume total 20 μL yang terdiri dari 5 μL template DNA, 1.4 μL Aquabidest, 1.6 μL primer forward konsentrasi 0,8 μM, 1.6 μL primer reverse konsentrasi 0,8 μM, 0.4 μL probe konsentrasi 0,2 μM, dan 10 μL LightCycler® 480 probe master enzim FastStart Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6.4 mM MgCl 2 . Masing-masing DNA template dimasukkan ke well terlebih dahulu kemudian master mix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan dan ditutup dengan sealing foil. Dilakukan proses pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah campuran reaksi total PCR dan program amplifikasi telah siap, campuran reaksi total PCR diletakkan pada multiwell plate yang ditutup menggunakan sealing foil, kemudian diletakkan pada mesin real-time PCR. Instrumen Real-Time PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung memberikan hasil amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva Roche c , 2008. Gambar.8. Program Amplifikasi Real-Time PCR Sumber : Roche c ,2008 30 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Pembuatan Simulasi Gummy Vitamin C

Gambar 9. Simulasi gummy vitamin C Pada penelitian ini dilakukan pembuatan simulasi gummy vitamin C yang terdiri dari simulasi gummy vitamin C sapi, simulasi gummy vitamin C babi, serta simulasi gummy vitamin C campuran sapi dan babi dengan persentase 1 babi, 25 babi, 50 babi, dan 75 babi. Formulasi simulasi gummy vitamin c yang digunakan adalah sukrosa dan glukosa sebagai pemanis, gelatin sebagai basis gummy, asam sitrat sebagai agen pengasam dan tartrazin sebagai pewarna. Formulasi gummy simulasi vitamin C merupakan modifikasi dari formulasi gummy yang terdapat pada Gelatine Handbook : Theory and Industrial Practice Schriber Gareis, 2007. Simulasi Gummy vitamin C yang dihasilkan pada penelitian ini memiliki sifat organoleptis yaitu berwarna oranye, memiliki rasa asam, kenyal, dan meleleh dalam mulut saat dikunyah. Berat sediaan gummy rata- rata 3,8 gr. Berat sediaan tersebut masih belum memenuhi standar berat sebenarnya yaitu 5 gr. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh beberapa hal diantaranya sisa larutan gummy masih ada yang menempel pada dinding cawan sehingga tidak tertuang keseluruhan.

4.2. Isolasi DNA

Proses isolasi DNA merupakan tahap awal sebelum dilakukannya analisis sumber DNA pada sediaan gummy simulasi vitamin C. Isolasi DNA dilakukan untuk mendapatkan DNA genom dari daging sapi, daging babi, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta gelatin sapi, gelatin babi, simulasi gummy vitamin C sapi, simulasi gummy vitamin C babi, serta simulasi gummy vitamin C campuran sapi dan babi dengan berbagai konsentrasi. Ada tiga tahap umum dalam proses isolasi DNA yaitu perusakan dinding sel lisis, pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA Ardiana, 2009. Pada penelitian ini isolasi DNA dilakukan dengan metode ekstraksi fase solid menggunakan matriks silika dari kit komersial High Pure PCR Template Preparation Roche. Alasan pemilihan metode ekstraksi dengan kit komersial ini dibandingkan dengan metode konvensial dikarenakan metode konvensional membutuhkan proses yang lama, jumlah sampel yang cukup banyak dalam mengekstraksi serta jumlah reagen yang begitu besar. Kit komersial yang digunakan pada penelitian ini menggunakan teknologi filter matriks silika untuk mengisolasi DNA dari sampel. Prinsipnya yaitu asam nukleat akan teradsorbsi oleh matriks silika pada filter dengan adanya garam chaotropic seperti natrium asetat, guanidin tiosianat atau guanidin hidroklorida. Adsorbsi asam nukleat dengan matriks silika disebabkan adanya afinitas tinggi antara rantai asam nukleat yang bermuatan negatif terhadap partikel silika bermuatan positif. Kekuatan adsorbsi silika terhadap asam nukleat bergantung pada kekuatan ion dan pH lingkungan. Asam nukleat yang teradsorbsi oleh silika akan mudah dibersihkan dari pengotor lainnya dibawah tekanan gaya sentrifugal. Asam nukleat yang teradsorbsi pada matriks silika dapat dielusi dengan menambahkan larutan rendah garam Tan C,S Yiap CB.,2009; Jaiprakash, 2014; Chacon Griffiths, 2014. Pada penelitian ini dilakukan beberapa modifikasi diantaranya pada berat sampel yang digunakan, penambahan volume pereaksi, kecepatan sentrifugasi, lama inkubasi, dan urutan langkah kerja. Sebelum memulai proses isolasi, DNA sampel dipresipitasi terlebih dahulu menggunakan isopropanol dan garam natrium asetat dengan volume yang sama. Adanya isopropanol dapat mengurangi kelarutan DNA pada air serta adanya garam natrium asetat berfungsi untuk mengikatkan muatan negatif pada gugus fosfat DNA dengan kation natrium asetat Greene, 1998. Langkah selanjutnya dalam isolasi DNA ini sampel dilisiskan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta terlebih dahulu dengan 200 µ L tissue lysis buffer. Larutan tissue lysis buffer mengandung EDTA yang merupakan zat yang mengikat ion magnesium pada dinding sel sehingga memudahkan proses pelisisan dinding sel Sudjadi, 2008. Urea 4M merupakan zat kaotropik yang mendenaturasi protein pada sel. Tris 200 mM sebagai buffer yang menjaga kestabilan pH DNA efektif pada pH 7-9 Tan Alex, 2014. Langkah selanjutnya sampel ditambahkan proteinase K lalu diinkubasi pada suhu 55ºC selama 24 jam. Proteinase K berfungsi sebagai pendegradasi protein yang terikat pada DNA. Proses degradasi protein diperlukan kondisi yang optimal pada suhu 50-55º C dengan pH 7.5 sampai 8 Kieleczawa, 2006. Selanjutnya ditambahkan 200 µ L binding buffer diinkubasi 10 menit pada suhu 70 ºC dan ditambahkan 250 µ L isopropanol untuk mengikat DNA pada membran. Larutan sampel kemudian dimasukkan pada filter tube yang telah terpasang pada collection tube kemudian disentrifugasi. Filter tube yang telah digunakan sebelumnya, dipasangkan collection tube baru dan ditambahkan inhibitor removal buffer.Tujuan dari penambahan inhibitor removal buffer ini adalah untuk menghilangkan zat-zat pengotor seperti protein yang menghambat pada amplifikasi PCR. Filter tube kemudian dipasangkan dengan collection tube baru dan ditambahkan wash buffer. Larutan wash buffer berfungsi menghilangkan sisa kotoran protein dan garam kaotropik yang terikat pada DNA. Setelah dilakukan pencucian, DNA yang terikat pada matriks silika kemudian dielusi dengan Elution Buffer yang telah dipanaskan pada suhu 70 °C, tujuan pemanasan untuk pengelusian isolat DNA secara optimal. Roche, 2012; Kennedy, 2010. Isolat DNA kemudian dianalisis konsentrasi dan kemurniannya dengan spektrofotometer DNA. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4.3. Analisa Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA Tabel .5. Konsentrasi dan kemurnian Isolat DNA Analisa konsentrasi dan kemurnian DNA dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer DNA. Prinsip kerja spektrofotometer DNA sesuai dengan spektrofotometer UV tetapi pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemurnian isolat DNA dilihat dengan rasio A260A280 adalah 1,8-2 Sambrook et al, 2001 ; Sudjadi, 2008;Conn, 2012. Konsentrasi DNA yang didapatkan pada daging sapi sebesar 36,45 ngµ L dan daging babi sebesar 46 ngµ L. Sedangkan gelatin sapi sebesar 29,44 ngµ L, gelatin babi sebesar 10,36 ngµ L, serta gummy 1 babi sebesar13,85 ngµ L, gummy 25 babi sebesar 10,23ngµ L, gummy 50 babi sebesar 12,06 ngµ L, dan gummy 75 babi sebesar 30,13 ngµ L. Konsentrasi isolat DNA daging yang didapatkan jauh lebih besar dibandingkan DNA gelatin dan DNA sampel gummy. Hal ini dikarenakan pada daging memiliki jumlah sel yang banyak dan belum mengalami proses pengolahan sedangkan gelatin merupakan produk hasil hidrolisis dari kolagen yang menyebabkan denaturasi DNA sehingga DNA yang NO SAMPEL KONSENTRASI ngµL KEMURNIAN A260A280 1 Daging sapi 36,54 1,923 2 Daging babi 46 1,804 3 Gelatin sapi 29,44 1,597 4 Gelatin babi 10,36 1,610 5 Gummy sapi 17,18 1,606 6 Gummy babi 18 1,645 7 Gummy campuran babi 1 13,85 1,565 8 Gummy campuran babi 25 10,23 1,588 9 Gummy campuran babi 50 12,06 1,504 10 Gummy campuran babi 75 30,13 1,638 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta didapatkan sedikit. Kemurnian DNA daging kisaran 1,9-1,8. Sedangkan kemurnian gelatin berada pada kisaran 1,6-1,5. Sampel gummy vitamin C memiliki kemurnian pada kisaran 1,5-1,6. Nilai kemurnian DNA pada daging termasuk dalam kategori murni karena memenuhi rasio antara 1,8- 2,0. Adapun nilai kemurnian DNA pada gelatin maupun sampel simulasi gummy vitamin C termasuk dalam kategori belum murni, karena nilai kemurnian dibawah 1,8. Nilai kemurnian DNA pada sampel gelatin sapi, gelatin babi, dan simulasi gummy vitamin C rendah disebabkan terdapat kontaminan protein dimana nilai kemurnian 1,5 memiliki perbandingan persentase protein dan asam nukleat yaitu sekitar 80 dan 20 selain hal tersebut sebanyak 92 komposisi gelatin adalah protein maka dari itu dengan presentase protein yang besar memungkinkan terdapat sisa protein yang tertinggal dalam isolat DNA Sambrook et al, 2001; Schrieber, 2007.

4.4. Amplifikasi DNA Daging, Gelatin, dan Sampel Simulasi Gummy