DNA Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real -Time PCR Untuk Analisis Kehalalan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada tanaman dan jamur Pemukaan lapisan flagella Kapsul atau lapisan yang berlendir ketika mengandung fibril atau flagelin Ketika terlihat seperti memiliki kandungan membran yang tertutup oleh mikrotubuli

2.5. DNA

Asam nukleat berfungsi menyimpan dan mentransmisikan informasi genetik dalam sel. Sel mempunyai dua jenis molekul asam nukleat yaitu DNA asam deoksiribonukleat dan RNA asam ribonukleat. DNA menyimpan informasi genetik yang spesifik untuk setiap individu dan spesies tertentu, yang akan diwariskan ke generasi berikutnya. Ghaffar,2009. DNA adalah polimer dari nukleotida-nukleotida. Nukleotida- nukleotida dalam DNA dihubungkan satu dengan yang lainnya oleh ikatan fosfodiester, yaitu ikatan yang terjadi antara Carbon katida dari satu nukleotida terdiri dari sebuah gula pantosa deoksiribosa, satu buah fosfat dan satu basa nitrogen. Basa nitrogen tersebut berikatan dengan karbon pertama dari gula deoksiribosa, sedangkan fosfat berikatan dengan karbon kelima dari gula yang sama Stryer, 1988. 2.5.1.Struktur DNA DNA merupakan polimer linier polinukleotida yang tersusun dari subunit atau monomer nukleotida. Komponen penyusun nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa deoksiribosa pada DNA atau ribosa pada RNA, basa nitrogen, dan gugus fosfat Gambar 2.1. Basa yang ditemukan pada nukleotida adalah basa purin adenin = A, guanin = G dan basa pirimidin cytosin = C, tymin = T, urasil = U Gambar 3. Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon 3’, gugus fosfat pada posisi karbon 5’ dan basa pada posisi karbon 1’ molekul gula. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui ikatan fosfodiester antara gugus 5’fosfat dengan gugus 3’hidroksil Ghaffar, 2007. Gambar.3. Struktur nukleotida Sumber: Ghaffar, 2009 Struktur molekul DNA merupakan rantai heliks ganda yang memutar ke kanan. Kedua rantai polinukleotida memutar pada sumbu yang sama dan bergabung satu dengan yang lainnya melalui ikatan hidrogen antara basa-basanya. Basa guanin berpasangan dengan basa cytosin, sedangkan basa adenin berpasangan dengan basa tymin. Antara basa guanin dan basa cytosin terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedang antara basa adenin dan tymin terbentuk dua ikatan hidrogen. Sehingga dalam molekul DNA jumlah basa G akan selalu sama dengan jumlah basa C, sedangkan jumlah basa A=T. Kemudian jumlah basa purin A + G akan sama dengan jumlah basa pyrimidin C + T. Kedua untai DNA saling berkomplementasi melalui basa penyusunnya dengan arah antiparalel berlawanan 5’→ 3’ vs 3’→5’, ujung yang mengandung gugus fosfat bebas disebut ujung 5’ sedangkan pada ujung lainnya yang mengandung gugus hidroksil bebas disebut ujung 3’. Kedua untai tersebut saling melilit satu sama lain membentuk struktur heliks ganda. Gugus fosfat dan gula yang tersusun bergantian menjadi tulang punggung backbone molekul DNA sementara pada bagian dalam terdapat basa yang melekat pada molekul gula. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar.4. Struktur DNA Sumber: Black, 2008 Untai heliks DNA dapat memisah menjadi struktur untai tunggal dengan adanya pemanasan dengan suhu tinggi 90°C, peristiwa ini sering dikenal dengan denaturasi. Denaturasi DNA bersifat reversible. Proses pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan terdenaturasi disebut renaturasi. Proses renaturasi dapat berjalan jika suhu mendekati suhu subdenaturasi mendekati 60°C Yuwono, 2009. Selain itu derajat keasaman pH yang ekstrim pH 3 atau pH 10 dapat menyebabkan DNA terdenaturasi Fatiyach et al, 2011. 2.5.2.Isolasi DNA Pada proses analisis atau proses yang berkaitan dengan DNA dibutuhkan proses isolasi dan purifikasi DNA yang mana DNA terbungkus di dalam sel. Sebuah teknik yang ideal harus mengoptimalkan hasil DNA, meminimalkan degradasi DNA, dan efisiensi dalam biaya, waktu dan tenaga Cheng Hon et al., 2010 . Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel lisis, pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease yang berfungsi mendegradasi protein dan RNase yang berfungsi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta untuk mendegradasi RNA, sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90°C untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA DNase. Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air Ghaffar, 2007; Ardiana, 2009. Salah satu cara untuk memecahkan sel dan mengisolasi DNA dengan menggunakan larutan EDTA, larutan tersebut mengandung ion pengkelat Mg2+ dikombinasi dengan enzim pendegradasi membran sel yaitu enzim lisozim. Setelah DNA terlepas dari sel maka selanjutnya dilakukan eliminasi RNA dengan enzim Rnase. Rapley dan Walker, 2000. RNAse merupakan endoribonuklease yang secara khusus mendegradasi C dan U pada untai tunggal RNA. RNase memotong rantai fosfodiester antara 5’-ribosa pada nukleotida dan kelompok fosfat pada 3’- ribosa pirimidin yang saling berdekatan Blackburn Moore, 1982; Raines, 1998. Adanya garam NaCl dengan konsentrasi tinggi dapat mengendapkan protein karena adanya fenomena salting-out Kurniati, 2009. Purifikasi DNA bertujuan untuk menghilangkan kontaminan protein selain DNA. Salah satu metode purifikasi DNA hasil ekstraksi adalah metode ekstraksi fenol-kloroform. Campuran fenol dan kloroform merupakan campuran yang homogen Sambrook dan Russell, 2001. Cara ini menghilangkan protein dengan penambahan fenol atau campuran fenol: kloroform : isoamil alkohol 50:49:1. Larutan organik ini mengendapkan protein yang akan menggumpal pada batas antara fase air dan fase organik. Fungsi isoamil alkohol untuk mencegah terjadinya emulsi Sudjadi, 2008. Metode pengendapan DNA paling banyak dilakukan dengan etanol yang mengandung natrium klorida pada suhu -20 C. Pada preparasi sampel DNA, setelah pengendapan dengan etanol, DNA disentrifugasi kemudian dilarutkan kembali dalam buffer TE. DNA plasmid dapat dimurnikan lebih lanjut dengan sesium klorida. Sedangkan preparasi DNA kromosom, endapan DNA akan berbentuk kabut putih berisi molekul DNA dalam bentuk benang panjang yang dapat diambil dengan batang pengaduk Sudjadi, 2008. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Pada zaman modern ini, telah dilakukan pengembangan dan modifikasi proses ekstraksi DNA, salah satunya menggunakan spin coloumn yang mengandung silicon dioxide. Prinsip dari metode ini adalah berdasarkan tingginya afinitas muatan negatif dari rantai utama DNA terhadap partikel silika yang bermuatan positif. DNA dapat terikat dengan kuat pada silika dibawah kondisi garam chaotropic seperti Guanidine-HCl. Garam ini dapat memecah ikatan hidrogen antara ion oksigen pada DNA dengan ion hidrogen pada air. DNA yang terabsorpsi oleh silika dapat dipisahkan dari protein dan sel debris dengan pencucian. DNA murni kemudian dapat dielusi dari silika dengan buffer Tris-EDTA atau Aquabidest Chee Tan dan Chin Yiap, 2009. Untuk mengukur DNA, dapat dilakukan pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometri UV. Kemurnian larutan DNA murni memiliki rasio A260A280 adalah 1,8. Jika rasio kurang dari 1,8 menunujukkan adanya pengotor protein atau fenol, sedangkan jika rasio lebih dari 1,8 menunjukkan adanya RNA Sudjadi, 2008. 2.5.3.DNA Mitokondria Mitokondria merupakan organel intraseluler dengan ukuran 0,2 µm sampai 0,5 µm, berbentuk bulat atau berbentuk tongkat. Mitokondria diselubungi oleh dua membran yaitu membran luar bersifat licin dan berhubungan dengan sitoplasma, sedangkan membran dalam berbentuk lekukan dan lipatan ke dalam disebut dengan krista. Fungsi mitokondria sebagai tempat respirasi sel, yaitu proses katabolik yang membutuhkan oksigen dalam produksi adenosin trifosfat ATP. Di dalam mitokondria mengandung DNA dan ribosom yang berfungsi melaksanakan proses sintesis protein Brensick, 1996. Ukuran DNA mitokondria pada hewan 15 sampai 20 kb dan mengandung 37 gen Boore, 1999. Penggunaan MtDNA dalam analisis karena memiliki jumlah kopi tinggi menjadikannya mudah diisolasi dan dipurifikasi untuk keperluan analisis genom Sholihin, 1994. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 5. Struktur DNA Mitokondria Sumber : Moraes et al, 2002

2.6. PCR