0,5. Oleh karena itu, asam salisilat dengan kadar 0,5 digolongkan sebagai kontrol negatif.
Arbutin yang digunakan adalah 5 dalam satu formula ±193,17 g sediaan. Arbutin yang digunakan sebanyak 9,659 g dalam formula lotion.
Arbutin aman digunakan dengan kadar maksimal 7, sehingga arbutin dengan kadar 5 digunakan sebagai kontrol negatif dalam penelitian ini
Brinkmann and Lindenmaier, 2004. Fase air terdidiri dari gliserin dan akuades. Gliserin yang digunakan
dalam fase air sebanyak 15 g dalam 47 g formula fase air. Gliserin yang digunakan dalam fase air sebanyak 31,91. Batas aman gliserin adalah
25 Paye, dkk, 2006, sehingga fase air ini bersifat iritatif kontrol positif.
Basis lotion terdiri dari semua bahan dalam formula lotion kecuali minyak peppermint. Formula lotion mengandung gliserin sebanyak 15 g
dalam ±193,17 g sediaan. Gliserin yang ada dalam sediaan sebanyak 7,76. Dan TEA yang terkandung dalam basis lotion sebanyak 0,08.
TEA aman digunakan sampai batas 5-10. Kadar ini tidak dapat menyebabkan iritasi pada kulit Dikshith, 2011. Oleh karena itu, basis
lotion bersifat tidak iritatif kontrol negatif.
C. Uji Iritasi Siput
Siput diambil dari wilayah Perumda, Ungaran, Jawa Tengah. Siput diletakkan pada wadah plastik yang diberi rongga dan diberi makan sawi
putih. Determinasi siput dilakukan dengan mencocokan karakteristik siput
dengan literatur. Klasifikasi siput dilakukan dengan membedah bagian perut siput dan dilihat bentuk alat kelamin yang dimiliki, sebagai pembeda
yang khas antar spesies. Hasil determinasi Lampiran 4 menyatakan bahwa siput yang digunakan sebagai hewan uji adalah jenis Laevicaulis
alte. Siput yang digunakan harus berwarna hitam, tidak cokat ataupun warna lainnya. Pada saat orientasi, siput yang memeiliki mantel berwarna
coklat akan menghasilkan mukus yang lebih banyak dibandingkan dengan siput yang memiliki warna mantel hitam. Kondisi siput harus dipastikan
dalam keadaan sehat, secara fisik tidak ada luka, tidak berlendir, dan mampu beraktivitas dengan baik. Jenis siput yang digunakan harus
diperhatikan dengan baik, siput dengan jenis berbeda dapat mengakibatkan hasil yang berbeda Dhondt, et al., 2006.
Uji iritasi siput dilakukan dengan mengambil 1 g sediaan atau bahan uji yang diletakkan dalam cawan petri. Siput diletakkan diatas
sediaan atau bahan uji yang akan digunakan dan didiamkan selama 1 jam. Hal ini bertujuan untuk melihat banyaknya mukus yang diproduksi oleh
siput akibat sediaan atau bahan uji. Dalam keadaan normal siput memproduksi mukus dalam jumlah tertentu, agar siput tidak mengalami
dehidrasi. Ketika siput terpapar zat yang dapat mengiritasi, maka siput akan memproduksi mukus sebagai mekanisme perlindungan dari dinding
tubuh siput. Semakin banyak mukus yang diproduksi, maka semakin iritan zat tersebut untuk tubuh siput Cock et al., 2011.
Siput dibersihkan dari mukus dengan menggunakan cutton bud, agar semua mukus dan sediaan yang masih menempel di tubuh siput dapat
bersih sehingga tidak menyebabkan kehilangan mukus. Siput diletakkan kedalam cawan petri baru yang berisi PBS dan didiamkan selama 1 jam.
CcOMB, Bowers, and Posen 1997 mengungkaokan bahwa ALP terdapat pada 3 daerah tubuh siput yaitu, saliran pencernaan, organ excretory, dan
pada bagian mantel. Aktivitas ALP meningkat jika terjadi kerusakan sel pada siput, dan LDH merupakan enzim sitolik yang akan dilepaskan
pertama kali saat terjadi kerusakan sel atau jaringan. Setelah 1 jam, cairan yang diperoleh diukur dimasukkan ke dalam microtube, dan diukur dengan
spektrofotometer UV-Vis.
Tabel VI. Data slug irritation test
Bahan uji
Replikasi Persen Mukus
ALP UL
LDH UL
Albumin µgmL
F as
e m
inya k
1 8,584
47,3 -3,36
75,805 2
9,102 16,5
29,814 3
9,232 31,9
-3,36 106,832
4 7,005
34,1 -3,36
78,176 5
2,093 14,3
-3,36 91,205
6 6,528
39,6 -3,36
441,989 7
5,855 20,9
482,759 8
6,000 12,1
3,36 13,793
9 5,745
39,6 23,52
103,896
B as
is
1 23,167
24,2 277,953
2 20,614
12,1 -33,6
104,348 3
23,816 30,8
-50,4 166,459
4 16,813
34,1 -3,36
286,645 5
18,208 22
3,36 286,645
6 15,217
15,4 3,36
563,536 7
20,089 24,2
-3,36 896,552
8 24,893
22 96,552
9 16,722
44 43,68
283,117
A rbut
in
1 26,789
42,9 -3,36
156,664 2
21,353 24,2
-23,52 24,845
3 26,695
11 3,36
52,174 4
15,240 19,8
-3,36 221,499
5 13,946
25,3 -3,36
169,381 6
14,338 6,6
3,36 519,337
7 22,038
31,9 606,897
8 25,532
29,7 -3,36
110,345 9
21,834 49,5
33,6 244,156
S L
S
1 28,964
33 42,956
2 26,564
20,9 -6,72
17,391 3
33,306 31,9
-77,28 57,143
4 25,822
7,7 -3,36
91,205 5
21,340 27,5
-6,72 195,439
6 16,730
15,4 -6,72
475,138 7
13,202 25,3
565,517 8
28,704 12,2
-3,36 110,345
9 14,025
74,8 30,24
514,286
A sa
m s
al is
il at
1 21,866
81,4 197,094
2 24,981
30,8 -6,72
34,783 3
14,685 22
-20,16 27,329
4 24,070
39,6 169,381
5 14,017
33 3,36
169,381 6
12,206 22
397,79 7
16,438 22
-3,36 468,965
8 23,055
17,6 -6,72
124,138 9
27,408 9,9
96,552
F as
e ai
r
1 24,765
31,9 -3,36
48,01 2
25,741 13,2
-3,36 3
25,336 18,7
-26,88 17,391
4 24,543
18,6 -6,72
130,293 5
24,227 26,4
3,36 117,264
6 -11,588
18,7 3,36
430,939 7
29,640 23,1
-3,36 579,31
8 28,324
25,3 -3,36
9 20,217
67,1 3,36
41,558
A kua
de s
1 16,720
12,1 6,72
96,02 2
17,809 8,8
3 -25,081
7,7 -3,36
19,875 4
-13,734 9,9
130,293
5 -21,656
7,7 -3,36
91,205 6
-20,085 6,6
364,641 7
-19,356 9,9
3,36 496,552
8 -22,663
15,4 -6,72
96,552 9
-24,362 2,2
3,36 -7,792
L ot
ion r
epe la
n
1 22,299
46,2 164,245
2 23,721
15,4 9,938
3 20,396
17,6 -26,88
52,174 4
15,798 9,9
-3,36 299,674
5 16,808
12,1 -3,36
156,352 6
19,120 8,8
-3,36 563,536
7 25,237
7,7 510,345
8 25,077
8,8 110,345
9 15,618
14,3 64,935
Tabel VII. Data Hasil Perhitungan Slug Irritation Test
Nama Bahan Persen Mukus
ALP UL LDH UL
Albumin µgmL
Fase Minyak 6,683
28,48 1,12
158,252 Basis lotion
19,95 25,42
-4,48 329,09
Arbutin 20,86
26,77 0,37
233,92 Asam Salisilat
19,86 30,92
-3,73 187,27
Sls 23,18
27,63 -8,21
229,94 Fase air
21,25 27,00
-4,11 151,64
Akuades -12,49
8,92 143,04
Sediaan lotion repelan 20,45
15,64 -4,11
214,62
Nilai ALP, LDH, dan Albumin diperoleh dari pengukuran sampel PBS yang direaksikan dengan masing-masing reagen Tabel I, II, dan III.
Alkaline phosphatase ALP merupakan katalis pada hidrolisis p- nitrofenilfosfat menjadi p-nitrofenol dan fosfat. P-nitrofenol mempunyai
absorbansi pada panjang gelombang 405 nm. P-nitrofenol yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi ALP pada sampel. Semakin banyak p-
nitrofenol yang terbentuk, maka semakin tinggi kadar ALP pada sampel. Reaksi hidrolisis sebagai berikut:
p-nitrofenilfosfat + H
2
O fosfat + p-nitrofenol
Albumin membentuk kompleks warna dengan bromkresol hijau BCG, intensitas warna yang terbentuk berbanding lurus dengan kadar
albumin dalam sampel. Reaksi kompleksasi BCG dan albumin sebagai berikut:
BCG + albumin kompleks BCG-Albumin
Lactat Dehydrogenase LDH merupkan enzim yang mengkatalisis perubahan piruvat menjadi 1-laktat. Jumlah laktat yang terbentuk
berbending lurus dengan konsentrasi katalis dari LDH yang ada pada sampel. Reaksi perubahan piruvat sebagai berikut:
Piruvat + NADH + H
+
Laktat + NAD
+
Tabel VI merupakan hasil replikasi dari sembilan kali uji iritasi dengan siput. Tabel VII menujukkann data rata-rata yang diperoleh dari
setiap parameter yang digunakan dalam uji iritasi dengan siput. Pada bahan uji akuades persen mukus yang diperoleh bernilai negatif
dikarenakan siput menyerap akuades dan tidak memproduksi mukus. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 7.
ALP
pH terkontrol
LDH
Gambar 7. Siput yang diberikan akuades Fase air dan sls menunjukkan persen mukus yang besar, yaitu
23,18 dan 21,25. Kedua bahan ini dikategorikan bahan yang bersifat iritatif. Produksi mukus cukup banyak karena sifat iritatif dari kedua bahan
tersebut. Fase minyak sebagai kontrol negatif menunjukkan hasil persen
mukus yang kecil, sehingga sesuai dengan sifat fase minyak. Namun hasil persen mukus yang dihasilkan kontrol negatif lainnya: basis lotion,
arbutin, dan asam salisilat menunjukkan hasil persen mukus yang besar, yang artinya mukus yang dihasilkan oleh siput cukup banyak jika
digolongkan sebagai bahan tidak iritatif kontrol negatif. Hal ini dapat disebabkan dari fase air dalam formula basis lotion. Fase air yang
mengandung gliserin diperkirakan dapat menyebabkan iritasi, sehingga persen mukus yang dihasilkan dipengaruhi dari gliserin dalam basis lotion.
Secara teoretis, gliserin dengan kadar diatas 25 dalam suatu formula dapat menyebabkan iritasi Paye, dkk, 2006. Dalam basis lotion hanya
digunakan hanya sebesar 7,76. Namun menghasilkan persen mukus yang cukup tinggi. Basis lotion juga mengandung TEA sebesar 0,07, yang
secara teoretis tidak menyebabkan iritasi. Ada kemungkinan gabungan dari setiap bahan yang digunakan dalam formula lotion dapat
menyebabkan sifat iritasi, sehingga siput memproduksi jumlah mukus yang banyak. Jika basis lotion yang digunakan dapat mengiritasi siput,
maka hasil mukus dari formula asam salisilat 0,5 dan formula arbutin 5 dapat dipengaruhi oleh basis lotion tidak mengandung zat aktif. Hasil
tersebut juga dapat dipengaruhi dari kondisi fisiologis siput, ada kemungkinan siput tidak dalam kondisi sehat atau dalam keadaan stress,
sehingga dapat menyebabkan produksi mukus yang tidak normal. Oleh karena itu, nilai persen mukus yang dihasilkan oleh kontrol negatif cukup
besar.
D. Validasi Protokol Uji SMI
