Uji in vivo validasi protokol slug irritation test pada sediaan lotion repelan minyak Peppermint (Mentha piperita) menggunakan metode Classification and Regression Trees (CART).

UJI IN VIVO DAN VALIDASI PROTOKOL SLUG IRRITATION TEST PADA SEDIAAN LOTION REPELAN MINYAK PEPPERMINT (Mentha

piperita) DENGAN METODE CLASSIFICATION AND REGRESSION TREES (CART)

Elisabeth Indah Susanto, Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt. Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

INTISARI

Produk kosmetik perlu diuji keamanannya, salah satu parameternya merupakan uji iritasi. Uji iritasi yang banyak digunakan adalah uji Draize test. Di beberapa negara di Eropa, penggunaan hewan vetrebrata sebagai hewan uji mulai dilarang. Slug Mucosal Irritation test (SMI) merupakan pengembangan metode yang direkomendasikan sebagai pengganti uji Draize. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas protokol slug irritation test pada sediaan lotion

minyak peppermint dengan metode classification and regression trees (CART). Metode ini menggunakan siput telanjang (Laevicaulis alte), dengan memberikan suatu senyawa terhadap siput dan siput akan memproduksi mukus dengan tingkat iritasi senyawa. Parameter yang digunakan untuk mengetahui tingkat iritasi suatu senyawa dalam penelitian ini adalah persen mukus, kadar ALP, LDH, dan Albumin. Kadar ALP, LDH, dan Albumin menunjukkan tingkat kerusakan jaringan yang terdapat pada tubuh siput. Hasil yang diperoleh akan dihitung menggunakan metode classification and regression tree (CART).

Metode ini dikatakan valid jika nilai spesifisitas dan sensitivitasnya >60%. Data penelitian menunjukkan bahwa metode ini valid dengan spesifisitas 86,67% dan sensitivitas 61,11%. Metode yang digunakan dapat dikatakan valid.

Lotion repelan minyak peppermint mengahasilkan persen mukus 20,45%, ALP 15,46 U/L, LDH -4,11 U/L, dan Albumin 214,62 µg/mL. Nilai ALP, LDH, dan Albumin tidak digunakan dalam penentuan sifat iritasi/non-iritasi, yang digunakan hanya persen mukus. Persen mukus digunakan sebagai parameter hasil statistik CART dengan cut off 0,245 (24,5%). Oleh karena itu lotion repelan minyak

peppermint bersifat non-iritatif.

Kata kunci : Slug mucosal irritation, iritasi, lotion, repelan, minyak peppermint,

ABSTRACT

Cosmetic products need to be tested for safety, one of the parameters is irritation test. Irritation test that is widely used is Draize test. In some countries in Europe, the use of vertebrae prohibited. Slug Mucosal Irritation Test (SMI) is a development method which is recommended as a substitute for Draize test. The aims of this study is to determine the validity of the protocol slug irritation test in preparation peppermint oil lotion with classification method and regression trees (CART).

This method uses slug (Laevicaulis alte), to give a compound against slugs and its would lay mucus production corresponded to the level of irritation compound. The parameters is used to determine the level of irritation of a compound in this study is the percent of mucus, ALP, LDH, and Albumin. Levels of ALP, LDH, and Albumin indicates the level of tissue damage found on the body of a snail. The results will be calculated using the method of classification and regression tree (CART).

This method is said to be valid if the value of the specificity and sensitivity> 60%. The research data shows that the method is valid with a specificity of 86.67% and a sensitivity of 61.11%. The method used can be said to be valid. Repelan lotion peppermint oil mengahasilkan percent mucus 20.45%, 15.46 ALP U/L, LDH -4.11 U/L, and albumin 214.62 mg/mL. Value ALP, LDH, and albumin is not used to determination of irritation/non-irritation, which is used only percent mucus. Percent mucus is used as a parameter CART statistical results with a cut off 0.245 (24.5%). Therefore, peppermint oil repelan lotion is non-irritating.

Keyword: Slug mucosal irritation,irritation, lotions, repellent, minyak peppermint, cut off, classification and regression tree (CART)

i

UJI IN VIVO DAN VALIDASI PROTOKOL SLUG IRRITATION TEST PADA SEDIAAN LOTION REPELAN MINYAK PEPPERMINT (Mentha

piperita) DENGAN METODE CLASSIFICATION AND REGRESSION TREES (CART)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

oleh:

Elisabeth Indah Susanto NIM : 118114022

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

iv

Halaman Persembahan

T hank Y ou T o JESUS CH R I ST

Semua yang t er jadi dalam hidup ini adalah

anuger ah T uhan yang begit u besar dan luar biasa

D an semyua yang T uhan ber ikan

selalu t epat pada wakt uN YA , t ak per nah

t er lambat , dan t ak per nah mendahului

semuana dir anc angkan T EPA T ^ .^

Ga n t u n gk a n l a h m i m p i m u d i p i n t u l a n gi t ,

f ok u s, d a n k ej a r l a h m i m p i m u

Ber u sa h a l a h sem a k si m a l m u n gk i n , b er d oa

n i sca y a Tu h a n a k a n m el en gk a p i y a n g k i t a

b u t u h k a n



Ku persembahkan untuk : Papa, Mama, Nicho, Tian, dan Robby Saudara, sahabat, teman, Alamamaterku

vii

PRAKATA

Puji dan syukur dipanjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas kasih, berkat, dan anugerah-Nya, akhirnya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan skripsi yang berjudul, “Validasi Protokol Slug Irritation Test Pada Sediaan

Lotion Repelan Minyak Peppermint (Mentha piperita) Dengan Metode

Classification And Regression Trees (CART)”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm) Universitas Sanata Dharma. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian Validasi Protokol Uji Iritasi Kulit Sediaan Bahan Alam berdasarkan prinsip 3R (Reduce, Refinement, dan Replacement) yang didanai oleh Dikti.

Penyelesaian dan penyusunan skripsi ini, penulis tidak terlepas dari bantuan, dukungan, dan bimbingan dari banyak pihak. Oleh karena itu pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt., selaku Kepala Program Studi Farmasi Universitas Sanata Dharma, dan selaku dosen pembimbing yang dengan tulus dan sabar telah memberikan bimbingan, dukungan, bantuan, kritik dan saran dalam menyeslesaikan skripsi ini.

2. Dr. Nunung Yuniarti, M.Si., Apt., dan Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji skripsi atas segala kritik dan saran, serta bimbingannya.

3. Bapak Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt., yang telah membantu penulis belajar statistika.

4. Ibu Agustina Setiawati selaku Kepala Laboratorium Universitas Sanata Dharma, atas bantuannya dalam pengurusan surat-menyurat dan ijin penggunaan laboratorium.

5. Bagian Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas Gajah Mada yang telah memberikan izin kepada penulis untuk melakukan penelitian.

6. Segenap staf laboratorium Pak Musrifin, Pak Agung, Pak Iswandi, Pak Bimo, dan Pak Khayat atas bantuan dan kerjasamanya.

viii

7. Yoanna Kristia N dan Carolina Dea S P sebagai teman dekat sekaligus teman satu kelompok penulis yang telah membantu, memberikan dukungan, kritik dan saran kepada penulis.

8. Orang tua yang selalu mendukung, membantu, memberikan semangat tak henti kepada penulis.

9. Teman-teman FST A 2011 atas kebersamaannya selama 4 semester ini. 10. Seluruh mahasiswa Farmasi Universitas Sanata Dharma angkatan 2011. 11. Seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu-persatu yang telah

membantu penulis dalam menyelesaikan penyusunan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa masih terdapat banyak kesalahan dan kekurangan dalam penyusunan skripsi ini mengingat keterbatasan dan kemampuan penulis. Oleh karena itu penulis ingin mendapatkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak untuk menyempurnakan skripsi ini. Akhir kata semoga penelitian dan skripsi ini dapat berguna bagi kemajuan ilmu pengetahuan khususnya di bidang ilmu farmasi.

ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii

HALAMAN PENGESAHAN ... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... v

LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI ... vi

PRAKATA ... vii

DAFTAI ISI ... ix

DAFTAR TABEL ... xi

DAFTAR GAMBAR ... xii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiii

DAFTAR SINGKATAN ... xiv

INTISARI ... xv

ABSTRACT ... xvi

BAB I. PENGANTAR ... 1

A. Latar Belakang ... 1

B. Permasalahan... 3

C. Keaslian Penelitian ... 3

D. Manfaat Penelitian ... 4

1. Manfaat teoretis ... 4

2. Manfaat praktis ... 4

E. Tujuan Penelitian ... 4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ... 6

A. Penelaahan Pustaka ... 6

B. Keterangan Empiris ... 15

BAB III. METODE PENELITIAN ... 17

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 17

B. Variabel dan Definisi Operasional ... 17

x

D. Tata Cara Penelitian ... 20

E. Analisis Hasil ... 25

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 27

A. Pembuatan Lotion Minyak Perppermint ... 27

B. Kotrol Positif dan Negatif Sediaan ... 29

C. Uji Iritasi Siput ... 31

D. Validasi Protokol Uji SMI ... 38

E. Penentuan Sifat Iritatif Lotion ... 40

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 42

A. Kesimpulan ... 42

B. Saran ... 42

DAFTAR PUSTAKA ... 43

LAMPIRAN ... 46

xi

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Komposisi dan konsentrasi reagen Albumin ... 19

Tabel II. Komposisi dan konsentrasi reagen LDH ... 19

Tabel III. Komposisi dan konsentrasi reagen ALP ... 20

Tabel IV. Formula kontrol positif dan negatif ... 21

Tabel V. Confusion Matrix... 26

Tabel VI. Data slug irritation test ... 33

Tabel VII. Data hasil perhitungan slug irritation test ... 35

Tabel VIII. Confusion Matrix prediksiCART ... 39

Tabel IX. Perhitungan Spesifisitas dan Sensitivitas ... 39

xii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur kulit ... 7

Gambar 2. Struktur Arbutin ... 10

Gambar 3. Struktur asam salisilat ... 11

Gambar 4. Laevicaulis alte ... 13

Gambar 5. Hasil uji daya sebar lotion repelan minyak peppermint ... 27

Gambar 6. Hasil uji viskositas sediaan lotion repelan minyak peppermint . 28 Gambar 7. Siput yang diberi akuades ... 36

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Data penimbangan formula lotion ... 47

Lampran 2. Dokumentasi lotion repelan minyak peppermint... 47

Lampiran 3. Dokumentasi Slug Irritation Test ... 48

Lampiran 4. Hasil determinasi Laevicaulis alte ... 49

Lampiran 5. Data Penimbangan Siput ... 50

Lampiran 6. Data persen mukus, ALP, LDH, dan albumin ... 52

Lampiran 7. Data prediksi spesifisitas dan sensitivitas ... 54

Lampiran 8. Hasil Classification and Regression Tree ... 56

Lampiran 9. Hasil Classification and Regression Tree metode anova ... 57

Lampiran 10. Tree Construction metode class ... 58

xiv

DAFTAR SINGKATAN CART : Classification and regression tree

SLS : Sodium Lauryl Sulfate

PBS : Phospate Buffer Salin

ALP : Alkali Phospatase LDH : Laktat Dehidrogenase TEA : Triethanolamin

xv

INTISARI

Produk kosmetik perlu diuji keamanannya, salah satu parameternya merupakan uji iritasi. Uji iritasi yang banyak digunakan adalah uji Draize test. Di beberapa negara di Eropa, penggunaan hewan vetrebrata sebagai hewan uji mulai dilarang. Slug Mucosal Irritation test (SMI) merupakan pengembangan metode yang direkomendasikan sebagai pengganti uji Draize. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas protokol slug irritation test pada sediaan lotion

minyak peppermint dengan metode classification and regression trees (CART). Metode ini menggunakan siput telanjang (Laevicaulis alte), dengan memberikan suatu senyawa terhadap siput dan siput akan memproduksi mukus dengan tingkat iritasi senyawa. Parameter yang digunakan untuk mengetahui tingkat iritasi suatu senyawa dalam penelitian ini adalah persen mukus, kadar ALP, LDH, dan Albumin. Kadar ALP, LDH, dan Albumin menunjukkan tingkat kerusakan jaringan yang terdapat pada tubuh siput. Hasil yang diperoleh akan dihitung menggunakan metode classification and regression tree (CART).

Metode ini dikatakan valid jika nilai spesifisitas dan sensitivitasnya >60%. Data penelitian menunjukkan bahwa metode ini valid dengan spesifisitas 86,67% dan sensitivitas 61,11%. Metode yang digunakan dapat dikatakan valid.

Lotion repelan minyak peppermint mengahasilkan persen mukus 20,45%, ALP 15,46 U/L, LDH -4,11 U/L, dan Albumin 214,62 µg/mL. Nilai ALP, LDH, dan Albumin tidak digunakan dalam penentuan sifat iritasi/non-iritasi, yang digunakan hanya persen mukus. Persen mukus digunakan sebagai parameter hasil statistik CART dengan cut off 0,245 (24,5%). Oleh karena itu lotion repelan minyak

peppermint bersifat non-iritatif.

Kata kunci : Slug mucosal irritation, iritasi, lotion, repelan, minyak peppermint,

xvi

ABSTRACT

Cosmetic products need to be tested for safety, one of the parameters is irritation test. Irritation test that is widely used is Draize test. In some countries in Europe, the use of vertebrae prohibited. Slug Mucosal Irritation Test (SMI) is a development method which is recommended as a substitute for Draize test. The aims of this study is to determine the validity of the protocol slug irritation test in preparation peppermint oil lotion with classification method and regression trees (CART).

This method uses slug (Laevicaulis alte), to give a compound against slugs and its would lay mucus production corresponded to the level of irritation compound. The parameters is used to determine the level of irritation of a compound in this study is the percent of mucus, ALP, LDH, and Albumin. Levels of ALP, LDH, and Albumin indicates the level of tissue damage found on the body of a snail. The results will be calculated using the method of classification and regression tree (CART).

This method is said to be valid if the value of the specificity and sensitivity> 60%. The research data shows that the method is valid with a specificity of 86.67% and a sensitivity of 61.11%. The method used can be said to be valid. Repelan lotion peppermint oil mengahasilkan percent mucus 20.45%, 15.46 ALP U/L, LDH -4.11 U/L, and albumin 214.62 mg/mL. Value ALP, LDH, and albumin is not used to determination of irritation/non-irritation, which is used only percent mucus. Percent mucus is used as a parameter CART statistical results with a cut off 0.245 (24.5%). Therefore, peppermint oil repelan lotion is non-irritating.

Keyword: Slug mucosal irritation,irritation, lotions, repellent, minyak peppermint, cut off, classification and regression tree (CART)

1 BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kulit merupakan bagian terbesar tubuh yang berfungsi untuk melindungi tubuh. Kulit melindungi tubuh dari bakteri maupun dari rangsangan mekanik dari luar yang dapat melukai tubuh. Iritasi merupakan suatu kondisi pada kulit terjadi akibat kontak dalam jangka panjang dengan bahan kimia tertentu. Dalam waktu tertentu, kulit akan mengering, nyeri, perdarahan, dan pecah-pecah (WHO, 2005).

Produk kosmetik perlu diuji keamanannya dengan identifikasi keamanan (hazard identfication), karakterisasin resiko (risk caracterization), evlauasi resiko (risk evaluation), dan keamanan (safety assement) (Leyden and Rawling, 2002). Uji iritasi dilakukan dengaan metode Draize, uji iritasi dengan menggunakan kelinci. Di beberapa negara di Eropa, mulai mengurangi penggunaan vertebrata atau hewan bertulang belakang untuk uji di laboratorium. Hewan vertebrata yang digunakan untuk model uji beberapa efek senyawa kimia telah dikurangi atau diminimalisir penggunaannya.

Menurut Leyden dan Rawling (2002) penggunaan hewan uji harus memenuhi syarat tiga R (three Rs) yaitu pengurangan (reduction), perbaikan (refinement), dan penggantian (replacement). Pengurangan (reduction) berarti menggunakan jumlah hewan uji yang paling sedikit sesuai dengan tujuan ilmiah yang akan dicapai dan memenuhi standar pengujian. Perbaikan (refinement) berarti bahwa prosedur yang digunakan harus mengurangi rasa stres,

ketidaknyamanan, atau interfensi dari kondisi normal hewan. Penggantian (replacement) dapat diartikan mengganti metode menggunakan hewan uji dengan metode lain tanpa menggunakan hewan uji, atau mengganti uji hewan dengan analogi dan interpretasi sesuai dengan tujuan yang ingin dicapai.

Menurut Adriaens (2006), mengembangkan metode (SMI) yang digunakan untuk uji iritasi pada mata menggantikan Uji Draize yang menggunakan kelinci. Slug Mucosal Irritation (SMI) menggunakan slug (Arion lusitancius) sebagai hewan uji. Kelebihan menggunakan SMI yaitu dapat memperkirakan respon klinik seperti gatal dan rasa terbakar. Parameter yang digunakan adalah Potensi iritasi dapat diprediksi berdasarkan jumlah mukus yang diproduksi.

Lotion adalah larutan atau suspensi obat di dalam air, ada saatnya ditambahkan alkohol. Lotion berfungsi untuk menyejukkan kulit karena menguapnya cairan (Ansel, 1989). Lotion merupakan emulsi cair, yang ditujukan untuk pemakaian luar. Lotion memiliki efek lubrikasi dan diaplikasikan terhadap area kulit yang mudah untuk mengalami gesekan seperti di antara jari-jari, di antara lipatan paha ataupun daerah di bawah lengan. Lotion sering digunakan secara terus menerus dalam kehidupan sehari-hari, sehingga dapat menimbulkan iritasi (Allen, 2002).

Minyak peppermint merupakan salah satu jenis minyak atsiri yang berasal dari Mentha piperita (famili Lamiaceae) dan dikenal dengan

tersebut memiliki sifat mudah menguap dan berbau menyengat, sehingga sering kali digunakan sebagai repelan (Alankar, 2009).

Gretha (2012) memformulasikan lotion repelan minyak peppermint,

tetapi belum dilakukan uji iritasi terhadap sediaan lotion minyak peppermint. Oleh krena itu, perlu dilakukan validasi protokol slug irittation test pada sediaan lotion repelan minyak peppermint sehingga dapat dijadikan salah satu pilihan alternatif uji iritasi tanpa menggunakan hewan vertebrata.

1. Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang tersebut, perumusan masalah yang diangkat dalam penelitian ini adalah:

1) Apakah protokol Slug Irritation Test untuk pengujian sediaan lotion

minyak peppermint dengan metode Classification and Regression Trees (CART) menunjukkan hasil yang valid?

2) Apakah sediaan lotion repelan minyak peppermint (topikal) bersifat iritatif atau non-iritatif?

2. Keaslian Penelitian

Sejauh pengetahuan penulis, penelitian tentang validasi Slug Irritation Test untuk pengujian sediaan lotion repelan minyak peppermint dengan metode

Classification and Regression Trees (CART), belum pernah dilakukan. Penelitian yang terkait dengan penelitian ini adalah :

a. “The Slug Mucosal Irritation assay: an alternative assay for local tolerance testing” yang dilakukan oleh Els Adriaens pada tahun 2006.

Dalam penelitian ini dilakukan uji iritasi mata, sediaan bucal, dan sediaan vaginal.

b. “Pengaruh Penambahan Polysorbate 40 dan Sorbitan Monostearate

Sebagai Emulsifying Agent dalam Lotion Repelan Minyak

Peppermint (Mentha piperita) Terhadap Sifat Fisis dan Stabilitas Sediaan” yang dilakukan oleh Elisabeth Dea Gretha pada tahun 2012. Dalam penelitian ini dilakukan uji sifat fisis dan stabilitas terhadap

lotion repelan dengan minyak peppermint

3. Manfaat Penelitian a. Manfaat Teoretis

Menambah wawasan mengenai Slug Irritation Test untuk pengujian sediaan topikal lotion repelan minyak peppermint.

b. Manfaat Praktis

Diharapkan penelitian selanjutnya dapat meminimalkan penggunaan kelinci sebagai hewan uji iritasi.

B. TujuanPenelitian 1. Tujuan umum

Mengetahui validitas protokol slug irritation test pada sediaan lotion

repelan minyak peppermint dengan metode classification and regression trees (CART).

2. Tujuan khusus

Jika protokol slug irritation test pada sediaan lotion repelan minyak

peppermint dengan metode classification and regression trees (CART) menunjukkan hasil yang valid, maka metode ini dapat digunakaan untuk mengetahui sifat iritatif suatu senyawa dalam sediaan topikal.

6 BAB II

A. PENELAAHAN PUSTAKA

1. Iritasi

Iritasi merupakan suatu kondisi pada kulit terjadi akibat kontak dalam jangka panjang dengan bahan kimia tertentu. Dalam waktu tertentu, kulit akan mengering, nyeri, perdarahan, dan pecah-pecah (WHO, 2005).

Iritasi ditunjukkan dengan gejala seperti panas karena adanya dilatasi pembuluh darah pada daerah yang kemerahan (eritema). Dapat juga terjadi udema karena perbesaran plasma yang membeku pada daerah yang terluka, dan dipercepat dengan adanya jaringan fibrosa yang menutupi daerah yang mengalami udema dan kemerahan (WHO, 2005).

2. Kulit

Kulit merupakan bagian terbesar tubuh yaitu mencapai 10% bobot individu dengan luas permukaan hingga 1,5-1,75 m2 (Walters and Roberts, 2002). Kulit bersifat elastik yang menjadi pelindung jaringan yang berada di bawahnya. Sifat protektif ini dapat menghindarkan tubuh dari zat-zat asing sepeti bakteri yang dapat membahayakan tubuh (Nugroho, 2013). Anatomi kulit dibagi menjadi empat lapisan jaringan yaitu stratum korneum, epidermis, dermis, dan subkutan. Struktur kulit ditunjukkan Gambar 1 (Walters and Roberts, 2002).

Stratum korneum berperan pada tahap penembusan sehingga dapat menentukan senyawa aktif pada sel target. Ketebalan stratum korneum dapat

dirangsang oleh paparan ulang senyawa kimia atau fisika. Respon ini melindungi epidermis dari ransangan luar (Mitsui 1997; Alache dan Herman, 1993).

Gambar 1. Struktur kulit (Dharmojono, 2002) 3. Lotion

Lotion merupakan sediaan cair (liquid) yang digunakan untuk penggunaan topikal pada kulit. Kebanyakan lotion terdiri dari serbuk yang larut dalam medium pendispersi. Lotion digunakan pada kulit sebagai pelindung kulit atau digunakan sampai efek terapetik tertentu (Ansel, 1989).

Lotion berfungsi untuk menyejukkan kulit karena menguapnya cairan (Ansel, 1989). Lotion merupakan emulsi cair, yang ditujukan untuk pemakaian luar. Lotion memiliki efek lubrikasi dan diaplikasikan terhadap area kulit yang mudah untuk mengalami gesekan, misal antara jari –jari (Allen, 2002).

Lotion memberikan efek lembab bagi kulit. Lotion lebih tipis dibandingkan dengan krim wajah, sehingga lotion lebih mudah tersebar dengan

luas area tubuh yang besar. Penggunaannya praktis dan mudah tersabsorpsi (Farrer, 2006).

4. Repelan

Repelan merupakan substansi yang digunakan untuk melindungi manusia, hewan, dan tanaman dari serangga dengan cara memberikan bau menyengat yang tidak enak dan tidak disenangi oleh serangga. Secara umum, repelan dibuat dalam bentuk emulsi, larutan, ataupun semisolid. Lamanya waktu perlindungan yang dapat diberikan adalah 30 menit sampai 2 jam, bahkan lebih. Repelan harus memenuhi beberapa syarat, yaitu tidak mengganggu pemakainya, tidak menimbulkan iritasi, tidak lengket, dan mempunyai daya pengusir terhadap serangga (Remington, 1980).

Repelan sebagai salah satu pestisida rumah tangga yang digunakan untuk melindungi tubuh dari gigitan nyamuk. Orang lebih mengenal dengan

lotion anti nyamuk. Produk repelan tidak hanya berbentuk lotion tetapi juga berbentuk semprot (spray), sehingga cara pemakaiannya dengan dioleskan atau disemprotkan ke kulit (BPOM, 2009).

5. Minyak Peppermint

Minyak peppermint merupakan minyak esensial yang mengandung mentol, limonen, dan metana. Minyak peppermint merupakan salah satu jenis minyak atsiri yang berasal dari Mentha piperita (famili Lamiaceae) dan dikenal dengan Pfefferminzblätter, Katzenkraut (Jerman), Metha poivree (Perancis). Senyawa tersebut memiliki sifat mudah menguap dan berbau menyengat, sehingga sering kali digunakan sebagai repelan (Alankar, 2009).

Minyak peppermint memiliki nama botani Mentha X piperita L. Bagian yang sering digunakan adalah daun dan minyak hasil penyulingannya. Minyak

peppermint tidak disarankan digunakan pada area wajah, kulit bayi, dan kulit anak kecil, khususnya di bagian hidung (Kuhn, and Winston, 2008). Minyak

peppermint dapat mengiritasi dalam kadar >4% dalam suatu formulasi. Namun pada orang yang sensitif kadar 0,1% pun sudah mampu mengiritasi (Balchin, 2006).

6. Sodium Lauryl Sulfate

Sodium Lauryl Sulfate (SLS) merupakan jenis surfaktan anionik. Surfaktan anionik sering digunakan sebagai cleanser dalam sabun. Surfaktan anionik mengadsopsi struktur lemak untuk meningkatkan permeabilitas lapisan bilayer. Sodium Lauryl Sulfate biasanya digunakan dalam range konsentrasi 0,01-2% (Leyden and Rawling, 2002). Sodium Lauryl Sulfate e dapat menyebabkan kemerahan pada kulit (skin erythema). Semakin besar konsentrasi SLS semakin tinggi tingkat kemerahan pada kulit. Konsentrasi maksimal SLS1% dalam sediaan (Rieger and Rhein, 1997).

7. Arbutin

Arbutin atau hidrokuinon-β-D-glukopiranosida (Gambar 3) tidak larut dalam eter, kloroform, dan karbon disulfida. Arbutin mudah mengalami hidrolisis oleh pengaruh asam encer atau enzim emulsin menjadi satu molekul glukosa dan satu molekul hidrokuinon (Sumardjo, 2009).

Gambar 2. Struktur Arbutin (Sumardjo, 2009)

Arbutin digunakan untuk pemutih kulit dan juga sebagai antioksidan. Arbutin memiliki efek pemutih yang kuat. Pemutihan oleh arbutin disebabkan oleh inibisi enzym tirosinase, yang merupakan enzim utama biosintesis melanin (Council of Europe, 2008). Arbutin aman digunakan dengan kadar maksimal 7%, sehingga digunakan sebagai kontrol negatif dalam penelitian kali ini (Brinkmann and Lindenmaier, 2004).

8. Asam Salisilat

Asam salisilat banyak digunakan dalam bahan kosmetik, khususnya sebagai bahan utama perawatan kulit. Asam salisilat mempunyai efek samping mengiritasi mukosa yang disebabkan oleh asetilasi gugus hidroksi (OH) (Leyden and Rawling, 2002).

Asam salisilat adalah asam 2-hidroksibenzen, yang ditunjukkan pada Gambar 3.

Gambar 3. Struktur asam salisilat (Leyden and Rawling, 2002) Asam salisilat banyak digunaan dalam produk kosmetik (kecantikan) dan dermatologis. Dosis aman penggunaan asam salisilat secara topikal yang digunakan terus menerus adalah 2-3%. Dosis asam salisilat dapat diberikan hingga 50% untuk peeling (Leyden and Rawling, 2002). Pada beberapa negara, asam salisilat dapat digunakan untuk obat jerawat dan perawatan kulit tetapi tidak digunakan dalam waktu yang lama, tidak digunakan untuk bagian tubuh yang besar, dan tidak diperbolehkan penggunaan untuk anak di bawah 3 tahun dikarenakan dapat menyebabkan iritasi pada kulit (Asean, 2003)

9. Gliserin

Gliserin banyak digunakan sebagai humektan dan emollient. Gliserin yang biasanya digunakan didalam formula adalah 20-30% w/w (William, and

Wilkins, 2006). Gliserin dapat larut dalam air dan alkohol, sedikit larut dalam aseton, dan sukar larut dalam kloroform dan eter. Gliserin dalam range 20-25% digunakan untuk mozturiezer pada kulit kering. Gliserin sampai dengan konsentrasi 25% aman digunakan dan dalam batas toleransi kulit (Paye, dkk, 2006). Gliserin yang digunakan sebagai emollient dan humektan kadar yang aman digunakan sampai dengan 65,7% (Smonlinske, 1992).

10. Triethanolamine (TEA)

Trietanolamin adalah campuran dari trietanolamina, dietanolamina, dan monoetanolamina. Mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih 107,4% dihitung terhadap zat anhidrat sebagai trietanolamina N(C2H4OH)3. trietanolamin berbentuk cairan kental, tidak berwarna hingga kuning pucat, bau lemah mirip amoniak, higroskopis. Kelarutan mudah larut dalam air dan dalam etanol (Rowe, et all, 2009). Trietanolamin dengan kadar 5-10% tidak dapat menyebabkan iritasi pada kulit (Dikshith, 2011).

11. Laevicaulis alte

Kalsifikasi dari siput telanjang :

Regnum : animalia

Phylum : mollusca

Classis : gastropoda

Ordo : systellommatophora

Familia : veronicellidae

Genus : laevicaulis

Species : Laevicaulis alte Férussac, 1822 (Brodie and Barker, 2012).

Gambar 4. Laevicaulis alte (Brodie and Barker, 2012)

Siput tanpa cangkang berwarna hitam dengan nama latin Laevicaulis alte. Bentuk siput telanjang ditunjukkan Gambar 5. Siput ini memiliki mantel yang menutupi seluruh punggung sampai kepala, memiliki sepasang mata yang berada dekat tentakel anterior. Mata dan tentakel dapat dilihat saat hewan dalam keadaan aktif. Mantel siput berwarna coklat tua sampai kehitaman dengan garis pucat yang membujur di tengah punggung (Ramakrishna, Jayashankar, Alexander, Thanuja, and Deepak, 2014).

Siput ini hidup di darat, dapat ditemukan di sampah, dedaunan, dan di bawah kayu, hidup di dataran rendah sampai tinggi, dan padang rumput dengan kelembaban yang tinggi. Siput ini merupakan hewan hermaprodit dan dapat berubah jenis kelamin semasa hidupnya. Panjang tubuhnya berkisar antara 0,5 – 4 cm. Populasi siput ini mencapai angka maksimum pada musim hujan yaitu mencapai 20 siput/m2 (Brodie and Barker, 2012).

12. Slug Iritation Test

Slug mucosal iritation test dapat digunakan untuk skrining sebuah riset tentang sediaan baru ataupun sediaan yang pernah ada untuk evaluasi toleransi lokal tanpa menggunakan hewan vertebrata. Uji SMI dapat digunakan

sebagai ganti Uji Draize. Uji SMI telah tervalidasi untuk skrining potensi iritan pada mata (Adriaens, 2006).

Kerusakan jaringan dapat diprediksi dengan adanya pelepasan protein dan enzim dari tubuh siput. Produksi protein, enzim, dan laktat dehidrogenase (LDH) dan alkalin fosfatase (ALP) digunakan sebagai parameter yang paling sesuai dengan kerusakan jaringan yang disebabkan oleh bahan uji. Saat terjadi kerusakan sel, enzim laktat dehidrogenase dilepaskan terlebih dahulu, dan enzim alkalin fosfatase dihasilkan setelah enzim laktat dehidrogenase karena alkalin fosfatase tidak terdapat dalam lapisan sel tetapi terdapat di jaringan penyambung bagian dasar (Adriaens, cit., Dhondt, 2005).

13. Validasi Alternatif Tes

Validasi metode alternatif didefinisikan sebagai proses di mana reliabilitas dan relevansi dari sebuah metode alternatif terjamin untuk tujuan penelitian (Balls, 1990).

Hubungan dari metode yang digunakan dievaluasi dengan beberapa metode statistik. Indeks, sensitifitas, dan spesifisitas dihitung. Indeks merupakan jumlah bahan yang diklasifikasikan benar dengan uji alternatif dibagi dengan total bahan uji. Sensitivitas adalah jumlah total bahan iritan yang diklasifikasikan secara benar dengan uji alternatif dibagi dengan jumlah total bahan iritan yang diuji. Spesifisitas adalah jumlah total bahan yang tidak mengiritasi yang telah diklasifikasikan secara benar dengan uji alternatif dibagi dengan jumlah total bahan yang tidak mengiritasi yang diuji. Metode

valid jika nilai sensitivitas dan spesifisitas >60% (Fentem et al., cit., Dhondt, 2005).

14. Classification and Regression Test (CART)

Classification and Regression Test (CART) merupakan metose statistik yang menggambarkan hubungan antara variabel respon (dependen) dengan variabel prediktor (bisa satu atau lebih). Apabila variabel respon berbentuk kontinu, maka metode yang digunakan adalah metode regresi pohon (regression trees). Apabila variabel respon memiliki skala kategorik, maka metode yang digunakan adalah metode klasifikasi pohon (classificaion trees). Tahap klasifikasi pohon terbagi menjadi 3, yang pertama adalah pemilihan pemilah. Pemilahan bergantung pada nilai yang berasal dari satu variabel independen. Tahap kedua yaitu penentuan simpul terminal. Simpul T dijadikan simpul terminal jika tidak ada penurunan keheterogenan yang berarti pada pemilahan, hanya ada satu pengamatan (n=1) pada tiap simpul anak atau ada batasan minimum n dan adanya batasan jumlah level kedalaman pohon maksimal. Tahap ketiga yaitu penandaan label tiap simpul terminal berdasar aturan jumlah anggota kelas terbanyak (Hartati, 2012).

B. Keterangan Empiris

Uji iritasi pada umumnya menggunakan uji Draize dengan hewan kelinci. Di beberapa negara Eropa, kelinci sudah mulai dilarang digunakan untuk hewan uji, sehingga perlu adanya metode pengganti uji Draize. Uji SMI dapat digunakan sebagai pengganti uji Draize. Siput mengeluarkan mukus

untuk melindungi dirinya dari serangan ataupun benda asing. Oleh karena itu, banyaknya mukus yang diproduksi dapat menggambarkan seberapa besar tingkat iritasi yang ditimbulkan suatu bahan atau senyawa uji dan kerusakan jaringan yang ditunjukkan dengan parameter ALP, LDH, dan albumin. Dari penelitian ini diharapkan protokol yang valid pada slug irritation test sebagai salah salu alternatif uji iritasi tanpa menggunakan hewan vertebata.

17 BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian dengan judul “Uji In Vivo Validasi Protokol Slug Irritation Test pada Sediaan Lotion Repelan Minyak Peppermint (Mentha piperita)

menggunakan metode Classification and Regression Trees (CART)” merupakan jenis penelitian eksperimental semu (quasi-experimental) pada uji

in vivo slug irritation test dan eksploratif pada validasi protokol slug irritation test dengan model prediksi yang dikembangkan menggunakan metode statistika classification and regression tree (CART).

B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel utama

a. Varibel bebas. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah zat uji yang iritattasi.

b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah respon iritatif yang dilihat dari jumlah produksi mukus, pengukuran protein, LDH, dan ALP.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah berat berat siput yang digunakan untuk slug irritation test 3-4 g.

b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah umur dan kondisi patologis siput

3. Definisi Operasional

a. Minyak pepper mint merupakan minyak yang berasal dari Mentha piperita dan diperoleh dengan cara destilasi uap.

b. Lotion merupakan emulsi encer yang berefek lubrikan dan didesain untuk pemakaian luar.

c. Siput atau slug merupakan jenis hewan non-vertebrata, tanpa cangkang dari spesies Laevicaulis alte (FéR), dipilih yang sudah dewasa, memiliki mantel berwarna hitam, tidak boleh coklat ataupun bertotol, memiliki berat 3-4 g. Sehat secara fisik, tidak ada luka, tidak berlendir, dan aktif bergerak.

d. Iritasi adalah kondisi pada kulit yang terjadi akibat kontak dalam jangka panjang dengan bahan kimia tertentu.

e. Mukus adalah lendir yang diproduksi oleh siput. C. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah glassware

(Pyrex®), cawan porselin, pengaduk, thermometer, timbangan analitik (Mettler Toledo®), horizontal double plate, stopwatch, hand mixer, cawan petri, pinset, mikropipet, labu ukur 5 mL, pipet tetes, mikro tube

(Effendrorf®), Spektofotometer UV-VISIBLE tipe UV mini-1240 (Shimadzu®) di Laboratorium Kimia Fisika Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

2. Bahan

Bahan yang digunakan minyak peppermint, Virgin Coconut Oil

(VCO), Tween 40, Span 80, asam stearat, gliserin, trietanolamin, cetyl alcohol, akuades, asam salisilat, arbutin, SLS, dan Phospate Buffer Salin (PBS).

3. Reagen

a. Reagen Albumin. Reagen albumin yang digunakan adalah reagen Albumin (ReiGed Diagnostics®). Komposisi dan konsentrasi dari reagen untuk penetapan kadar albumin disajikan pada Tabel I.

Tabel I. Komposisi dan konsentrasi reagen Albumin Komposisi Konsentrasi (mM)

Bromcresol green 0,25

Succinat Buffer 85

Surfactant

pH 4,20 ± 0,1

b. Reagen LDH. Reagen LDH yang digunakan adalah reagen LDH FS-DGKC (DiaSys®). Komposisi dan konsentrasi dari reagen untuk penetapan kadar LDH disajikan pada Tabel II.

Tabel II. Komposisi dan konsentrasi reagen LDH Komposisi pH Konsentrasi (mmol/ L) R1 Phospate buffer 7,5 64

Pyruvate 0,80 R2 Good’s buffer 9,6

c. Reagen ALP. Reagen ALP yang digunakan adalah reagen ALP (ReiGed Diagnostics®). Komposisi dan konsentrasi dari reagen untuk penetapan kadar ALP disajikan pada Tabel III.

Tabel III. Komposisi dan konsentrasi reagen ALP Komposisi Konsentrasi (mM)

Reagen 1 Diethanolamine 1,0

Magnesium chloride 0,5 Reagen 2 p- Nitrophenylphosphatase

pH 10,4 ± 0,2 10,0

4. Hewan Uji

Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah siput tanpa cangkang berwarna hitam dengan spesies Laevicaulis alte (FéR) dengan berat badan 3-4 g. Siput diperoleh dari daerah Ungaran, Jawa Tengah.

D. Tata Cara Penelitian 1. Pembuatan Lotion repelan minyak peppermint

a. Pemilihan Formula

Formula yang digunakan mengacu pada formula Elisabeth Dea (2012). Formula yang digunakan pada penelitan ini adalah: R/Virgin coconut oil 6 g

Tween 40 4 g

Span 80 4 g

Asam stearat 2,74 g

Gliserin 15 g

TEA 0,15g

Minyak peppermint 1,74 g

Akuades ad 32 g

b. Formula Kontrol Positif Dan Negatif

Tabel IV. Formula Kontrol Positif dan Negatif Bahan Fase

mi-nyak (g) Fase air (g) Basis lotion (g) Asam salisi-lat 0,5% (g) SLS 1% (g) Arbu -tin 5% (g) Aqua -dest (g)

VCO 6 - 6 6 6 6 -

Tween 40 4 - 4 4 4 4 -

Span 80 4 - 4 4 4 4 - Asam

stearat 2,74 - 2,74 2,74 2,74 2,74 -

Gliserin - 15 15 15 15 15 -

TEA 0,15 - 0,15 0,15 0,15 0,15 -

Cetyl

alcohol 0,5 - 0,5 0,5 0,5 0,5 -

Akuades - 32 32 32 32 32 32

Asam

salisilat - - - 0,32 0,644 3,22 -

Sifat bahan

Non-iritan Iritan

Non-iritan

Non-iritan Iritan

Non-iritan

Non-iritan

c. Pembuatan Lotion Repelan

Semua bahan dipanaskan di atas waterbath. (1) Setelah meleleh asam stearat, cetyl alcohol, dan span 80 dicampur, ditambahkan dengan TEA, aduk hingga homogen. (2) VCO dan

tween 40 dicampur dan diaduk hingga homogen. (3) Campuran nomor (1) dan nomor (2) dicampur dan diaduk hingga homogen.

(4) Gliserin dan 1/3 akuades dicampurkan, aduk hingga homogen. Campuran nomor (3) diaduk dengan mixer dengan kecepatan 1 selama 5 menit. Pada menit ke-5 campuran nomor (4) dimasukkan, kemudian 2/3 sisa akuades dimasukkan secara perlahan. Pada 30 detik terakhir, minyak peppermint dimasukkan, aduk hingga homogen.

2. Uji sifat fisis sediaan lotion repelan minyak peppermint a. Uji Daya Sebar

Uji daya sebar dilakukan setelah 48 jam pembuatan sediaan

lotion dengan menimbang sebanyak 1 g dan diletakkan di atas kaca berbentuk bulat berskala dan ditutup dengan kaca bulat penutup. Kaca bulat tersebut diberi beban 125 g dan didiamkan selama 1 menit, serta diukur daya penyebarannya.

b. Uji Viskositas

Uji viskositas dilakukan setelah 48 jam pembuatan sediaan

lotion menggunakan viskometer Rion. 3. Pembuatan bahan uji iritasi (dalam basis lotion)

Semua bahan dipanaskan di atas waterbath. (1) Setelah meleleh asam stearat, cetyl alcohol, dan span 80 dicampur, ditambahkan dengan TEA, aduk hingga homogen. (2) VCO dan tween 40 dicampur dan diaduk hingga homogen. (3) Campuran nomor (1) dan nomor (2) dicampur dan diaduk hingga homogen. (4) Gliserin dan 1/3 akuades dicampurkan, aduk hingga homogen. Campuran nomor (3) diaduk dengan mixer dengan kecepatan 1

selama 5 menit. Pada menit ke-5 campuran nomor (4) dimasukkan, kemudian 2/3 sisa akuades dimasukkan secara perlahan. Pada 30 detik terakhir, asam salisilat/ sls/ arbutin dimasukkan, aduk hingga homogen. 4. Pengumpulan dan Determinasi Siput

Siput diperoleh dari wilayah Perumda, Ungaran-Kabupaten Semarang. Determinasi dilakukan di Laboratorium Taksonomi Hewan Universitas Gajah Mada. Siput yang diperoleh dibedah, dilihat bentuk alat reproduksinya, dan disesuaikan dengan literatur.

5. Slug Irritation test

Uji iritasi menggunakan slug irritation test diadaptasi dari prosedur uji

Slug Mucosal Test (Adriens, 2006). Uji iritasi dievaluasi dengan menempatkan siput pada bahan uji dalam periode waktu 60 menit dan diukur jumlah lendir yang diproduksi. Masing-masing siput dan cawan petri ditimbang. Bahan uji ditimbang 1 g, dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian siput diletakkan di atas bahan uji dan ditunggu selama 60 menit. Setelah kontak selama 60 menit, kemudian hitung jumlah mukus yang terbentuk. Siput kemudian dipindah ke cawan petri baru, kemudian diberikan 1 mL PBS di dekat bagian bawah tubuh siput dan didiamkan selama 60 menit. Bahan uji yang menyebabkan kerusakan jaringan akan menghasilkan pelepasan biomarker ke PBS, sehingga protein dan enzim dapat diukur dalam sampel PBS. protein dan enzim yang dikeluarkan (laktat dehidrogenase (LDH) dan alkali fosfatase (ALP)) dari dinding

tubuh siput dapat diukur. Kemudian sampel diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

6. Pengukuran ALP

Mukus yang diproduksi setelah ditambahkan PBS diambil 20 µL, dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL. Ditambahkan reagen pertama (Tabel III) sebanyak 800 µL dan reagen kedua (Tabel III) sebanyak 200 µL. Kemudian aquades ditambahkan hingga 5 mL dan didiamkan selama 3 menit. Pengukuran absorbansi dilakukan kembali pada waktu 4, 5, dan 6 menit. Absorbansinya dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 405 nm.

7. Pengukuran LDH

Mukus yang diproduksi setelah ditambahkan PBS diambil 20µ l, dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL. Ditambahkan reagen pertama (Tabel II)sebanyak 800 µ dan reagen kedua (Tabel II) 200 µL. Kemudian aquades ditambahkan hingga 5 mL dan didiamkan selama 1 menit. Pengukuran absorbansi dilakukan kembali pada waktu 2, 3, dan 4 menit. Absorbansinya dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 340 nm.

8. Pengukuran kadar albumin

Mukus yang diproduksi setelah ditambahkan PBS diambil 8 µl, ditambahkan dengan 800 μL reagen albumin (Tabel I). Ditambahkan 3200 μL akuades. Absorbansi senyawa dibaca pada panjang gelombang 630 nm.

E. Analisis Hasil

 Perhitunganpersenmukus

% mukus = bobot mukus yang dipr oduksi

bobot siput x 100%

 Perhitungan aktivitas ALP

ALP [U/L] = Δabsorbansi/menit x faktor koresponding (3.300)

 Perhitungan aktivitas LDH

Aktivitas LDH [U/L] = Δabsorbansi/menit x faktor koresponding (10.080)

 Perhitungan aktivitas Albumin

Albumin g _dL = Absor bansi sampel

Absor bansi standarx konsentr asi standar (

g

dL)

 Penentuan nilai cut off

Nilai cut off didapatkan dari faktor yang digunakan untuk prediksi respon iritasi berdasarkan variabel persen mukus, kadar ALP, kadar LDH, dan kadar Albumin menggunakan Classification and Regression Tree.

 Penentuan jumlah data true positive, false positive, true negative, false negative

Data hasil uji iritasi diprediksi sebagai iritan ataupun non-iritan sesuai nilai cut off dari faktor yang digunakan. True positive, false positive, true negative, false negative dinyatakan jika:

Tabel V. Confusion Matrix Prediksi CART Iritan Non-iritan

L

it

er

at

u

r _{Iritan true positive false negative} Non-iritan false positive true negative

 Perhitungan nilai sensitivitas dan spesifisitas

1) Spesifisitas =

2) Sensitivitas =

Keterangan: TP = True Positive TN = True Negative FP = False Positive FN = False Negative

 Prediksi sifat iritatif sediaan lotion repelan minyak peppermint

Hasil data yang menunjukkan spesifisitas dan sensitivitas >60%, dapat diprediksikan sifat iritatif dari sediaan. Prediksi dilakukan sesuai dengan faktor klasifikasi dan nilai cut off yang didapatkan dari perhitungan sebelumnya.

27 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pembuatan Lotion Repelan Minyak Peppermint

Formula yang digunakan dalam penelitian ini yaitu cetyl alcohol

sebagai agen penstabil sistem emulsi dan akan membuat medium pendispersi dari sediaan lotion menjadi lebih viskous (kental), virgin coconut oil (VCO) sebagai fase minyak, asam stearat sebagai agen konsistensi dan ketahanan sediaan lotion, gliserin sebagai humektan dan

emollient, minyak peppermint sebagai bahan aktif. Salah satu bahan dalam formula berbeda dengan formula yang digunakan Gretha (2012), yaitu span 60 (sorbitan monostearat) digantikan dengan span 80. Span 80 memiliki sifat sama dengan span 60, namun span 80 lebih oily dibandingkan dengan span 60, karena span 80 memiliki nilai HLB 4,3, lebih rendah dibandingkan span 60 yaitu 4, 7, sehingga span 80 lebih mudah bercampur pada fase miyak lotion. Hydrophylic-lipophylic Balance (HLB) digunakan untk mendeskripsikan karakteristik suatu surfatkatan. Hydrophylic-lipophylic Balance merupakan angka yang menunjukkan perbandingan antara kelompok senyawa hidrofilik dan lipofilik. Apabila nilai HLB dari surfaktan rendah, maka jumlah gugus yang bersifat hydrophylic dalam suatu surfaktan adalah kecil. Hal ini menunjukkan bahwa, sifat dari surfaktan tersebut lebih

liphofilic (oil soluble) atau lebih mudah larut dalam fase minyak (Allen, 2002; Hartono dan Widiatmoko, 1993).

Uji daya sebar dilakukan dengan plat kaca bulat berskala. Lotion

ditimbang sebanyak 1 g di atas plat kaca, di tutup dengan plat kaca lain dan diberi beban 125 g, serta di diamkan selama 1 menit. Hasil uji daya sebar menunjukkan lotion memiliki daya sebar yang tidak dapat diukur, karena

lotion yang diletakkan di atas plat memenuhi plat sampai ke tepi plat (daya sebar lotion tidak dapat didefinisikan, ukurannya tidak dapat dibaca karena terlalu luas). Daya sebar digunakan untuk mengetahui kemampuan lotion

untuk dapat menyebar secara merata ke seluruh permukaan kulit. Besarnya nilai daya sebar erat kaitannya dengan acceptability dari suatu sediaan. Sediaan yang daya sebarnya kecil menunjukkan bahwa sediaan sulit untuk menyebar. Sifat ini berbanding terbalik dengan viskositas. Jika viskositasnya kecil, maka daya sebarnya besar.

Gambar 5. Hasil uji daya sebar lotion repelan minyak peppermint

Uji viskositas dilakukan dengan viskometer Rion dan Gambar 6 menunjukkan hasil viskositas lotion sebesar 5 d.Pa.s. Pada pengukuran viskositas digunakan pemberat nomor 1, sehingga pada viskometer Rion dibaca pada skala 1 menunjukkan angka 5 dan dibaca sebagai nilai

viskositas lotion. Hal ini menunjukkan bahwa viskositas lotion kecil. Jika dibandingkan dengan teori, maka hal ini sudah sesuai dengan teori yang menunjukkan viskositas berbanding terbalik dengan daya sebar. Semakin kecil viskositas, maka semakin besar daya sebarnya.

Gambar 6. Hasil uji viskositas sediaan lotion repelan minyak peppermint

B. Kontrol Positif dan Negatif Sediaan

Penelitian ini menggunakan 2 kontrol positif dan 5 kontrol negatif. Kontrol negatif dan positif ditentukan dari sifat bahan uji yang digunakan secara teoretis. Kadar atau batas aman penggunaan bahan uji adalah parameter yang digunakan untuk menentukan sifat bahan uji. Jika bahan uji secara teoretis mengiritasi, maka dijadikan sebagai kontrol positif. Sedangkan jika bahan uji secara teoretis tidak mengiritasi, maka bahan uji dijadikan sebagai kontrol negatif. Kontrol positif yang digunakan adalah SLS 1% dan fase air. Fase air terdiri dari gliserin dan akuades. Kontrol negatif yang digunakan adalah fase minyak sediaan lotion, basis sediaan

lotion, asam salisilat 0,5%, arbutin 5%, dan akuades. Fase minyak terdiri dari VCO, tween 40, span 80, asam stearat, TEA, dan cetyl alcohol. Seluruh bahan yang digunakan dalam fase minyak tidak iritatif (kontrol

negatif). Basis lotion terdiri dari VCO, tween 40, span 80, asam stearat, TEA, cetyl alcohol, gliserin, dan akuades. Asam salisilat dan arbutin dibuat dengan menggunakan semua bahan dengan prosedur pembuatan

lotion dengan mengganti minyak peppermint dengan asam salisilat atau arbutin. Akuades digunakan sebagai kontrol negatif.

Sodium Lauryl Sulfate yang digunakan adalah 1% dalam satu formula (±193,17 g sediaan). Sodium Lauryl Sulfate yang digunakan sebanyak 1,932 g dalam formula lotion. Sodium Lauryl Sulfate yang digunakan sebesar 1%, karena SLS dapat mengiritasi kulit dengan menyebabkan warna merah atau kemerahan pada kulit dengan konsentrasi maksimal 1% (Rieger dan Rhein, 1997).

Asam salisilat yang digunakan adalah 0,5% dalam satu formula (±193,17 g sediaan). Asam salisilat yang digunakan sebanyak 0,966 g dalam formula lotion. Asam salisilat yang digunakan sebesar 0,5%, karena asam salisilat aman digunakan pada range 2-3% (Leyden and Rawling, 2002). Pada tahap orientasi asam salisilat yang digunakan adalah konsentrasi 2% dan siput yang diberi perlakuan asam salisilat 2% mati, sehingga tidak dapat dilanjutkan pada prosedur selanjutnya. Siput yang mati saat diberi sediaan tidak lagi dapat memproduksi mukus sesuai dengan tingkat iritasi sediaan dan berhenti memproduksi ALP dan LDH yang akan digunakan sebagai parameter uji iritasi siput. Secara teoretis aman digunakan dan siput tidak mati saat diberi perlakuan asam salisilat

0,5%. Oleh karena itu, asam salisilat dengan kadar 0,5% digolongkan sebagai kontrol negatif.

Arbutin yang digunakan adalah 5% dalam satu formula (±193,17 g sediaan). Arbutin yang digunakan sebanyak 9,659 g dalam formula lotion. Arbutin aman digunakan dengan kadar maksimal 7%, sehingga arbutin dengan kadar 5% digunakan sebagai kontrol negatif dalam penelitian ini (Brinkmann and Lindenmaier, 2004).

Fase air terdidiri dari gliserin dan akuades. Gliserin yang digunakan dalam fase air sebanyak 15 g dalam 47 g formula fase air. Gliserin yang digunakan dalam fase air sebanyak 31,91%. Batas aman gliserin adalah 25% (Paye, dkk, 2006), sehingga fase air ini bersifat iritatif (kontrol positif).

Basis lotion terdiri dari semua bahan dalam formula lotion kecuali minyak peppermint. Formula lotion mengandung gliserin sebanyak 15 g dalam ±193,17 g sediaan. Gliserin yang ada dalam sediaan sebanyak 7,76%. Dan TEA yang terkandung dalam basis lotion sebanyak 0,08%. TEA aman digunakan sampai batas 5-10%. Kadar ini tidak dapat menyebabkan iritasi pada kulit (Dikshith, 2011). Oleh karena itu, basis

lotion bersifat tidak iritatif (kontrol negatif). C. Uji Iritasi Siput

Siput diambil dari wilayah Perumda, Ungaran, Jawa Tengah. Siput diletakkan pada wadah plastik yang diberi rongga dan diberi makan sawi putih. Determinasi siput dilakukan dengan mencocokan karakteristik siput

dengan literatur. Klasifikasi siput dilakukan dengan membedah bagian perut siput dan dilihat bentuk alat kelamin yang dimiliki, sebagai pembeda yang khas antar spesies. Hasil determinasi (Lampiran 4) menyatakan bahwa siput yang digunakan sebagai hewan uji adalah jenis Laevicaulis alte. Siput yang digunakan harus berwarna hitam, tidak cokat ataupun warna lainnya. Pada saat orientasi, siput yang memeiliki mantel berwarna coklat akan menghasilkan mukus yang lebih banyak dibandingkan dengan siput yang memiliki warna mantel hitam. Kondisi siput harus dipastikan dalam keadaan sehat, secara fisik tidak ada luka, tidak berlendir, dan mampu beraktivitas dengan baik. Jenis siput yang digunakan harus diperhatikan dengan baik, siput dengan jenis berbeda dapat mengakibatkan hasil yang berbeda (Dhondt, et al., 2006).

Uji iritasi siput dilakukan dengan mengambil 1 g sediaan atau bahan uji yang diletakkan dalam cawan petri. Siput diletakkan diatas sediaan atau bahan uji yang akan digunakan dan didiamkan selama 1 jam. Hal ini bertujuan untuk melihat banyaknya mukus yang diproduksi oleh siput akibat sediaan atau bahan uji. Dalam keadaan normal siput memproduksi mukus dalam jumlah tertentu, agar siput tidak mengalami dehidrasi. Ketika siput terpapar zat yang dapat mengiritasi, maka siput akan memproduksi mukus sebagai mekanisme perlindungan dari dinding tubuh siput. Semakin banyak mukus yang diproduksi, maka semakin iritan zat tersebut untuk tubuh siput (Cock et al., 2011).

Siput dibersihkan dari mukus dengan menggunakan cutton bud, agar semua mukus dan sediaan yang masih menempel di tubuh siput dapat bersih sehingga tidak menyebabkan kehilangan mukus. Siput diletakkan kedalam cawan petri baru yang berisi PBS dan didiamkan selama 1 jam. CcOMB, Bowers, and Posen (1997) mengungkaokan bahwa ALP terdapat pada 3 daerah tubuh siput yaitu, saliran pencernaan, organ excretory, dan pada bagian mantel. Aktivitas ALP meningkat jika terjadi kerusakan sel pada siput, dan LDH merupakan enzim sitolik yang akan dilepaskan pertama kali saat terjadi kerusakan sel atau jaringan. Setelah 1 jam, cairan yang diperoleh diukur dimasukkan ke dalam microtube, dan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis.

Tabel VI. Data slug irritation test Bahan

uji

Replikasi Persen Mukus ALP (U/L) LDH (U/L) Albumin (µg/mL) F as e m inya k

1 8,584% 47,3 -3,36 75,805

2 9,102% 16,5 0 29,814

3 9,232% 31,9 -3,36 106,832

4 7,005% 34,1 -3,36 78,176

5 2,093% 14,3 -3,36 91,205

6 6,528% 39,6 -3,36 441,989

7 5,855% 20,9 0 482,759

8 6,000% 12,1 3,36 13,793

9 5,745% 39,6 23,52 103,896

B

as

is

1 23,167% 24,2 0 277,953

2 20,614% 12,1 -33,6 104,348

3 23,816% 30,8 -50,4 166,459

4 16,813% 34,1 -3,36 286,645

5 18,208% 22 3,36 286,645

6 15,217% 15,4 3,36 563,536

7 20,089% 24,2 -3,36 896,552

8 24,893% 22 0 96,552

A

rbut

in

1 26,789% 42,9 -3,36 156,664

2 21,353% 24,2 -23,52 24,845

3 26,695% 11 3,36 52,174

4 15,240% 19,8 -3,36 221,499

5 13,946% 25,3 -3,36 169,381

6 14,338% 6,6 3,36 519,337

7 22,038% 31,9 0 606,897

8 25,532% 29,7 -3,36 110,345

9 21,834% 49,5 33,6 244,156

S

L

S

1 28,964% 33 0 42,956

2 26,564% 20,9 -6,72 17,391

3 33,306% 31,9 -77,28 57,143

4 25,822% 7,7 -3,36 91,205

5 21,340% 27,5 -6,72 195,439

6 16,730% 15,4 -6,72 475,138

7 13,202% 25,3 0 565,517

8 28,704% 12,2 -3,36 110,345

9 14,025% 74,8 30,24 514,286

A sa m s al is il at

1 21,866% 81,4 0 197,094

2 24,981% 30,8 -6,72 34,783

3 14,685% 22 -20,16 27,329

4 24,070% 39,6 0 169,381

5 14,017% 33 3,36 169,381

6 12,206% 22 0 397,79

7 16,438% 22 -3,36 468,965

8 23,055% 17,6 -6,72 124,138

9 27,408% 9,9 0 96,552

F

as

e

ai

r

1 24,765% 31,9 -3,36 48,01

2 25,741% 13,2 -3,36 0

3 25,336% 18,7 -26,88 17,391

4 24,543% 18,6 -6,72 130,293

5 24,227% 26,4 3,36 117,264

6 -11,588% 18,7 3,36 430,939

7 29,640% 23,1 -3,36 579,31

8 28,324% 25,3 -3,36 0

9 20,217% 67,1 3,36 41,558

A

kua

de

s 1 16,720% 12,1 6,72 96,02

2 17,809% 8,8 0 0

3 -25,081% 7,7 -3,36 19,875

5 -21,656% 7,7 -3,36 91,205

6 -20,085% 6,6 0 364,641

7 -19,356% 9,9 3,36 496,552

8 -22,663% 15,4 -6,72 96,552

9 -24,362% 2,2 3,36 -7,792

L ot ion r epe la n

1 22,299% 46,2 0 164,245

2 23,721% 15,4 0 9,938

3 20,396% 17,6 -26,88 52,174

4 15,798% 9,9 -3,36 299,674

5 16,808% 12,1 -3,36 156,352

6 19,120% 8,8 -3,36 563,536

7 25,237% 7,7 0 510,345

8 25,077% 8,8 0 110,345

9 15,618% 14,3 0 64,935

Tabel VII. Data Hasil Perhitungan Slug Irritation Test

Nama Bahan Persen Mukus

(%) ALP (U/L) LDH (U/L)

Albumin (µg/mL)

Fase Minyak 6,683 % 28,48 1,12 158,252

Basis lotion 19,95 % 25,42 -4,48 329,09

Arbutin 20,86 % 26,77 0,37 233,92

Asam Salisilat 19,86% 30,92 -3,73 187,27

Sls 23,18% 27,63 -8,21 229,94

Fase air 21,25% 27,00 -4,11 151,64

Akuades -12,49% 8,92 0 143,04

Sediaan lotion repelan 20,45% 15,64 -4,11 214,62

Nilai ALP, LDH, dan Albumin diperoleh dari pengukuran sampel PBS yang direaksikan dengan masing-masing reagen (Tabel I, II, dan III).

Alkaline phosphatase (ALP) merupakan katalis pada hidrolisis p -nitrofenilfosfat menjadi p-nitrofenol dan fosfat. P-nitrofenol mempunyai absorbansi pada panjang gelombang 405 nm. P-nitrofenol yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi ALP pada sampel. Semakin banyak p

-nitrofenol yang terbentuk, maka semakin tinggi kadar ALP pada sampel. Reaksi hidrolisis sebagai berikut:

p-nitrofenilfosfat + H2O fosfat + p-nitrofenol

Albumin membentuk kompleks warna dengan bromkresol hijau (BCG), intensitas warna yang terbentuk berbanding lurus dengan kadar albumin dalam sampel. Reaksi kompleksasi BCG dan albumin sebagai berikut:

BCG + albumin kompleks BCG-Albumin

Lactat Dehydrogenase (LDH) merupkan enzim yang mengkatalisis perubahan piruvat menjadi 1-laktat. Jumlah laktat yang terbentuk berbending lurus dengan konsentrasi katalis dari LDH yang ada pada sampel. Reaksi perubahan piruvat sebagai berikut:

Piruvat + NADH + H+ Laktat + NAD+

Tabel VI merupakan hasil replikasi dari sembilan kali uji iritasi dengan siput. Tabel VII menujukkann data rata-rata yang diperoleh dari setiap parameter yang digunakan dalam uji iritasi dengan siput. Pada bahan uji akuades persen mukus yang diperoleh bernilai negatif dikarenakan siput menyerap akuades dan tidak memproduksi mukus. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 7.

ALP

pH terkontrol

Gambar 7. Siput yang diberikan akuades

Fase air dan sls menunjukkan persen mukus yang besar, yaitu 23,18% dan 21,25%. Kedua bahan ini dikategorikan bahan yang bersifat iritatif. Produksi mukus cukup banyak karena sifat iritatif dari kedua bahan tersebut.

Fase minyak sebagai kontrol negatif menunjukkan hasil persen mukus yang kecil, sehingga sesuai dengan sifat fase minyak. Namun hasil persen mukus yang dihasilkan kontrol negatif lainnya: basis lotion, arbutin, dan asam salisilat menunjukkan hasil persen mukus yang besar, yang artinya mukus yang dihasilkan oleh siput cukup banyak jika digolongkan sebagai bahan tidak iritatif (kontrol negatif). Hal ini dapat disebabkan dari fase air dalam formula basis lotion. Fase air yang mengandung gliserin diperkirakan dapat menyebabkan iritasi, sehingga persen mukus yang dihasilkan dipengaruhi dari gliserin dalam basis lotion. Secara teoretis, gliserin dengan kadar diatas 25% dalam suatu formula dapat menyebabkan iritasi (Paye, dkk, 2006). Dalam basis lotion hanya digunakan hanya sebesar 7,76%. Namun menghasilkan persen mukus yang cukup tinggi. Basis lotion juga mengandung TEA sebesar 0,07%, yang

secara teoretis tidak menyebabkan iritasi. Ada kemungkinan gabungan dari setiap bahan yang digunakan dalam formula lotion dapat menyebabkan sifat iritasi, sehingga siput memproduksi jumlah mukus yang banyak. Jika basis lotion yang digunakan dapat mengiritasi siput, maka hasil mukus dari formula asam salisilat 0,5% dan formula arbutin 5% dapat dipengaruhi oleh basis lotion (tidak mengandung zat aktif). Hasil tersebut juga dapat dipengaruhi dari kondisi fisiologis siput, ada kemungkinan siput tidak dalam kondisi sehat atau dalam keadaan stress, sehingga dapat menyebabkan produksi mukus yang tidak normal. Oleh karena itu, nilai persen mukus yang dihasilkan oleh kontrol negatif cukup besar.

D. Validasi Protokol Uji SMI

Validasi protokol ujidilakukan dengan Metode Classification and Regression Tree (CART) pada prog Rstudio. Prediksi sifat iritatif bahan uji dengan memasukkan data hasil uji iritasi sebagai penanda klasifikasi. Persen mukus digunakan untuk memprediksi seberapa besar potensi iritasi, sedangkan kadar ALP, LDH, dan Albumin digunakan untuk memprediksi kerusakan jaringan yang terjadi pada siput.

Tree construction dibuat untuk menentukan klasifikasi bahan berdasarkan variabel uji iritasi. Gambar 8 menunjukkan bahwa parameter utama yang digunakan untuk mengelompokkan sifat bahan uji adalah persen mukus. Jika bahan uji memiliki nilai persen mukus ≥0,245 atau ≥24,5%, maka akan di kategorikan bersifat iritan. Jika persen mukus

<0,245 atau <24,5%, maka bahan uji akan dikelompokkan ke sifat non-iritan.

Gambar 8. Hasil tree construction dari metode CART

Sensitivitas dan spesifisitas metode, ditentukan dari perhitungan nilai positif benar (true positive), negatif benar (true negative), positif palsu (false positive) dan negatif palsu (false negative) dengan menggunakan confusion matrix.

Tabel VIII. Confusion Matrix prediksi CART Prediksi CART Iritan Non-iritan

L

it

er

at

u

r Iritan 11 7

Non-iritan 6 39

Tabel IX. Perhitungan Spesifisitas dan Sensitivitas Sensitivitas

= = 0,611

Spesifisitas = = 0,8667

Berdasarkan Tabel IX, nilai spesifisitas yang diperoleh sebesar 86,67% dan sensitivitas yang diperoleh sebesar 61,11%. Metode slug irritation test dikatakan valid jika nilai keduanya >60% (Fentem et al. cit., Dhondt, 2005). Dapat disimpulkan bahwa metode ini valid untuk menentukan sifat iritatif sediaan lotion repelan minyak peppermint. Cut off

yang diperoleh dari metode ini adalah 0,245 (Gambar 8). Jika persen mukus yang didapat ≥0,245, maka lotion repelan bersifat iritatif.

Metode CART yang digunakan adalah metode CART dengan

class, hasil yang diperoleh menyajikan tree construction yang cukup baik. Parameter utama yang digunakan untuk penentuan sifat bahan adalah persen mukus, jika persen mukus <0,245 maka nilai kategori 0, dan jika mukus ≥0,245 maka nilai kategori 1 (Gambar 8). Metode class digunakan untuk memprediksi suatu populasi bersifat iritan atau tidak iritan dengan hasil deskripsi nilai 0 dan 1. Berbeda dengan metode anova, hasil metode anova pada Lampiran 11, membentuk cabang pohon baru dengan parameter albumin <414,4 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa sesungguhnya kategori nilai 0 pada metode class belum tentu bersifat non-iritan, harus dilihat kembali nilai albuminnya. Jika nilai albumin <414,4 µg/mL, maka masuk ke kategori nilai 0 atau jika nilai albumin ≥414,4 µg/mL, maka masuk ke kategori nilai 1. Pada Lampiran 11, nilai albumin <414,4 membentuk cabang lagi berdasarkan nilai persen mukus <0,19. Oleh karena itu metode anova digunakan untuk mengetahui detail penggolongan sifat suatu populasi.

Nilai ALP dan LDH pada perhitungan statistik CART tidak digunakan sebagai parameter dalam penggolongan sifat bahan, dikarenakan nilai ALP dan LDH mungkin tidak cukup stabil sehingga CART tidak menggunakan hasil keduanya dalam menggolongkan sifat iritatif dan non-iritatif. Berdasarkan Tabel IV, nilai ALP dan nilai LDH memiliki variasi yang cukup besar dalam satu bahan uji juga, sehingga sistem tidak membacanya sebagai parameter utama dalam penggolongan.

E. Penentuan Sifat Iritatif Lotion Repelan Minyak Peppermint Tabel X. Hasil rata-rata Sediaan Lotion

Nama Bahan Persen Mukus

(%) ALP (U/L) LDH (U/L)

Albumin (µg/mL)

Sediaan lotion repelan 20,45% 15,64 -4,11 214,62

Lotion repelan minyak peppermint diprediksi bersifat iritatif menggunakan metode slug iritation test. Berdasarkan Tabel X, lotion repelan minyak peppermint

memiliki persen mukus sebesar 20,45%, cut off dari metode ini sebesar 24,5%. Nilai albumin lotion repelan sebesar 214,62, pada metode anovapun (Lampiran 11) menunjukkan hasil lotion repelan minyak peppermint bersifat non-iritan. Oleh karena itu lotion minyak peppermint ditentukan bersifat non-iritan.

42 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

a. KESIMPULAN

1. Protokol uji iritasi dengan siput atau slug irritation test menjukkan hasil yang valid untuk pengujian iritasi sediaan lotion repelan minyak

peppermint dengan metode Classification and Regression Tree (CART), spesifisitas metode 86,67%, sensitivitas 61,11%, dan cut off metode adalah persen mukus sebesar 0,245 (24,5%).

2. Berdasarkan nilai cut off yang didapatkan dari metode CART, sediaan

lotion repelan minyak peppermint bersifat non-iritan sebagai sediaan topikal.

b. SARAN

1. Uji SMI perlu dikembangkan lebih lanjut dan perlu dilakukan penelitian yang lebih intensif, agar dapat digunakan sebagai metode uji iritasi pengganti metode Uji Draize.

2. Perlu diperjelas dan dipertegas antara bahan yang tidak iritatif dengan bahan iritatif dalam penggolongannya secara teoretis.

DAFTAR PUSTAKA

Adriaens, E., 2006, The Slug Mucosal Irritation Assay : An Alternative Assay for Local Tolerance Testing, National Centre for The Replacement, Refinement and Reduction of Animals In Research, 1-9.

Alache, J. M. D. J., dan Herman, A. M. G., 1993, Farmasetika 2 Biofarmasi, Edisi 2, Airlangga University Press, Surabaya

Alankar, Shrivastava, A Review On Peppermint Oil, 2009, Asian Jurnal of Pharmaceutical and Clinic Research, 2(2), 27-33.

Allen, L. V., 2002, The Art Science, and Technology of Pharmaceutical Compounding, 2nd Ed, American Pharmaceutical Assosiation, USA, pp. 263, 265, 267, 269, dan 275.

Ansel H. C., 1989, Introduction to Pharmaceutical Dosage Form, Lea & Febiger, Philadelphia, pp. 250-251, 253, 390

ASEAN, 2003, Asean Cosmetic Documents, Asesan Sekretariat, Jakarta, hal. 144-145

Balchin, L. Maria, 2006, Aromatherapy Science; A guide for healtcare professionals, First Edition, Pharmaceutical Press, London, pp. 275-277 Balls et al, 1990, The Three Rs: The Way Forward: The Report and

Recommendations of ECVAM Workshop, Utrecht University, The Netherlands.

BPOM, 2009, Persyaratan Teknis Bahan Kosmetika, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal. 40

Brinkmann, A. J., and Lindenmaier, P. M., 2004, Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals; A Handbook for Practice on a Scientific Basic, Third Edition, GbH Scientific Publishers, Germany, p. 627

Brodie, G., and Barker, G.M., 2012, Laevicaulis alte (Férussac,1822), Fanily Veronicellidae, USP Introduced Land Snails of the Fiji Island Fact Sheet Series, No. 3.

Cock, L., et al., 2011, Mucosal Irritation Potential of Polyelectrolyte Multilayer Capsules, Biomaterials, 32, 1967-1977.

Council of Europe, 2008, Active Ingridients Used in Cosmetics: Safety Survey, Council of Europe Publishing, Europe, p.p. 33-35

Dharmojono, 2002, Kapita Selekta Kedokteran Veteriner (Hewan Kecil), Edisi Pertama, Yayasan Obor Indonesia, Jakarta, hal. 109

Dhondt, M., 2005, Optimisation and Validation of An Alternative Mucosal Irritation Test, Dissertation, Ghent University, Belgium, 2, 14, 36.

Dhondt, M., Adriaens, E., Pinceel, J., Jordaens, K., Backeljau, T., and Remon, J.P., 2006, Slug Species-And Population-Specific Effects on The End Points of The Slug Mucosal Irritation Test, Toxicology In Vitro, 20, 448-457.

Dikshith, T.S.S., 2011, Handbook of Chemical and Safety, CRC Press, United States, p. 278

Enesis Group ; http://www.enesis.com/product/detail/id/5, diakses pada tanggal 25 Mei 2015, jam 17.55

Farrer H. G., 2006, Natural Beauty Recipe Book; How To Make Your Own Organic Cosmetics and Beauty Products, Quarry Books, United State, pp. 49-50

Gandjar, Ibnu Gholib, dan Rohman, Abdul, 2012, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 459- 471.

Gomes, S. R., and J. W., Thome, 2004, Diversity & Distribution pf the Veronicellidae in the Oriental & Australian Biogeographical regions, Memoirs of the Queensland Museum, Vol 49; part 2

Greta, Z. E. D., 2012, Pengaruh Penambahan Polysorbate 40 dan Sorbitan Monostearate sebagai Emulsifying Agent dalam Lotion Repelan Minyak Peppermint (Mentha piperita) Terhadap Sifat Fisis dan Stabilitas Sediaan,Skripsi, 35-40 Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Hartati, A., Zain, Ismaini dan Ulama, Brodjol Sutijo S., 2012, Analisis CART (Classification And Regression Trees) pada Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Kepala Rumah Tangga di Jawa Timur Melakukan Urbanisasi, Jurnal Sains Dan Seni ITS Vol. 1, No. 1, (Sept. 2012), D-100.

Hartono, A.J., dan Widiatmoko, M.C., 1993, Emulsi dan Panga Instan Berlesitin, Edisi pertama, Andi Ofset, Yogyakarta, hal 16-19

Kuhn, A. M., and Winston, David, 2008, Herbal Therapy & Supplements; A Scientific and Traditional Approach, Second Edition, Wolters Kluwer Health, Philadelphia, pp.342-344

Leyden, J.J. and Rawling A. V., 2002, Skin Moisturation, Edisi 1, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 625, 353-363,209-211, 409-412

Mitsui, T., 1997, New Cosmetic Sciense, Elsevier, Amsterdam, hal. 38-44

Nugroho, K. N., 2013, Sediaan Transdermal : Solusi Masalah Terapi Obat, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal. 9-37

Paye, Marc, dkk, 2006, Handbook of Cosmetic and Science and Technology, Second Edition, CRC Press, pp. 268-269

Ramakrishna, S., Jayashankar, M., Alexander, R., Thanuja, B.G., and Deepak,P., 2014, Morphometric Studies of The Tropical Leatherleaf Slug

Laevicaulis Alte (Férussac, 1822), International Global Journal for Research Analysis, 3 (3), 190-201.

Remington, 1980, Pharmaceutical Sciences: Pesticides, Marck Publishing Company, Penilsivania, pp. 1840

Rieger and Rhein, 1997, Surfactans in Cosmetics, Second Edition, vol 68, Marcel Dekker Inc., New York, p. 492

Rowe, et all, 2009, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th edition, Pharmaceutical Press, London, pp. 155-156

Smolinske. C. S., 1992, Handbook of Food, Drug and Cosmetic Excipients, CRC Press LLC, United State America, p. 199

Sumardjo, Damin, 2009, Pengantar Kimia, Cetakan I, EGC, Jakarta, hal. 234 Van Benthem Jutting, W. S. S., 1952, Systematic Studies on the Non-Marine

Mollusca of the Indo-Australian Archipelago, III, Critical Revision of the Javanese Pulmonate Landsnails of the Families Ellobiidae to Limacidae, with an Appendix on Helicarionidae, Treubia, Vol 21; part 2, printed by Archipel-Bogor (Java)

Williams, L., and Wilkins, 2006, Remington; The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, Library of Congres Catalog, Philadelphia, pp. 747-748

Walters, K. A., and Roberts, M. S., 2002, Dermatological and Transdermal Formulations, Marcel Dekker Inc., New York, pp. 99-102

World Health Organization, 2005, International Health Regulations, Second Edition, Swiss

Lampiran 1. Data Penimbangan Formula Lotion

Bahan Penimbangan

wadah (g)

Penimbangan wadah + zat

(g)

Berat zat (g)

Virgin coconut oil

Tween 40

Span 80 Asam stearat Gliserin TEA

Cetyl alcohol

Minyak peppermint

Akuades ad 36,931 88,103 54,487 32,910 53,435 27,392 31,771 30,007 32 mL 76,635 114,545 79,985 50,989 152,126 28,499 35,109 41,518 32 mL 39,704 26,442 25,498 18,079 98,691 1,107 5,102 11,511 32 mL

Lampran 2. Dokumentasi lotion repelan minyak peppermint

Lampiran3. Dokumentasi Slug Irritation test

Perlakuan siput terhadap bahan uji

Laevicaulis alte

Lampiran 5. Data Penimbangan Siput Bahan uji Berat Siput (g) Berat petri (g) Berat petri + sediaan (g) Berat petri + sediaan + cutton bud (g)

Berat petri + sediaan + cutton bud + mukus (g)

Berat mukus (g) F as e m inya k

3,366 43,856 45,047 45,256 45,197 -0,059

3,390 34,474 35,474 35,613 35,904 0,291

3,966 46,821 47,821 48,012 48,373 0,361

3,737 43,853 44,838 45,047 45,392 0,345

3,569 51,020 52,020 52,239 52,489 0,250

3,823 43,751 44,751 44,978 45,058 0,080

3,018 51,020 52,020 52,226 52,423 0,197

3,279 43,752 44,752 44,958 45,150 0,192

3,900 47,494 48,500 48,646 48,880 0,234

3,290 46,911 48,091 48,254 48,443 0,189

B

as

is

lot

ion

3,736 47,569 48,741 49,115 49,009 -0,106

3,6 45,66 46,66 46,804 47,638 0,834

3,386 39,09 40,09 40,228 40,926 0,698

3,737 47,568 48,544 48,733 49,623 0,89

3,878 43,388 44,388 44,522 45,174 0,652

3,427 43,794 44,794 44,99 45,614 0,624

3,588 43,376 44,376 44,531 45,077 0,546

3,161 43,792 44,792 44,996 45,631 0,635

3,495 40,631 41,653 41,805 42,675 0,87

3,002 46,447 47,498 47,664 48,166 0,502

A

rbut

in

3,548 46,509 47,681 48,074 47,984 -0,090

3,963 45,310 46,310 46,478 47,54 1,062

3,386 46,906 47,906 48,138 48,861 0,723

3,495 43,784 44,761 44,96 45,893 0,933

3,878 47,578 48,578 48,773 49,364 0,591

3,872 35,797 36,797 36,984 37,524 0,54

3,829 47,575 48,575 48,751 49,3 0,549

3,326 35,797 36,797 36,949 37,682 0,733

3,431 43,37 44,373 44,505 45,381 0,876

2,922 37,91 38,921 39,067 39,705 0,638

S

L

S

3,673 45,742 46,950 47,644 47,534 -0,110

3,418 41,802 42,802 43,072 44,062 0,990

4,013 47,752 48,752 48,932 49,998 1,066

3,702 45,740 46,747 46,897 48,130 1,233

cpd result mukus ldh alp alb pred TP FP TN FN fase minyak 0 0,086 -3,36 47,3 75,805 0 0 0 1 0 fase minyak 0 0,091 0 16,5 29,814 0 0 0 1 0 fase minyak 0 0,092 -3,36 31,9 106,832 0 0 0 1 0 fase minyak 0 0,070 -3,36 34,1 78,176 0 0 0 1 0 fase minyak 0 0,021 -3,36 14,3 91,205 0 0 0 1 0 fase minyak 0 0,065 -3,36 39,6 441,989 0 0 0 1 0 fase minyak 0 0,059 0 20,9 482,759 0 0 0 1 0 fase minyak 0 0,060 3,36 12,1 13,793 0 0 0 1 0 fase minyak 0 0,057 23,52 39,6 103,896 0 0 0 1 0 Basis 0 0,232 0 24,2 277,953 0 0 0 1 0 Basis 0 0,206 -33,6 12,1 104,348 0 0 0 1 0 Basis 0 0,238 -50,4 30,8 166,459 0 0 0 1 0 Basis 0 0,168 -3,36 34,1 286,645 0 0 0 1 0 basis 0 0,182 3,36 22 286,645 0 0 0 1 0 basis 0 0,152 3,36 15,4 563,536 0 0 0 1 0 basis 0 0,201 -3,36 24,2 896,552 0 0 0 1 0 basis 0 0,249 0 22 96,552 1 0 1 0 0 basis 0 0,167 43,68 44 283,117 0 0 0 1 0 arbutin 0 0,268 -3,36 42,9 156,664 1 0 1 0 0 arbutin 0 0,214 -23,5 24,2 24,845 0 0 0 1 0 arbutin 0 0,267 3,36 11 52,174 1 0 1 0 0 arbutin 0 0,152 -3,36 19,8 221,499 0 0 0 1 0 arbutin 0 0,139 -3,36 25,3 169,381 0 0 0 1 0 arbutin 0 0,143 3,36 6,6 519,337 0 0 0 1 0 arbutin 0 0,220 0 31,9 606,897 0 0 0 1 0 arbutin 0 0,255 -3,36 29,7 110,345 1 0 1 0 0 arbutin 0 0,218 33,6 49,5 244,156 0 0 0 1 0 texapon 1 0,290 0 33 42,956 1 1 0 0 0 texapon 1 0,266 -6,72 20,9 17,391 1 1 0 0 0 texapon 1 0,333 -77,3 31,9 57,143 1 1 0 0 0 texapon 1 0,258 -3,36 7,7 91,205 1 1 0 0 0 texapon 1 0,213 -6,72 27,5 195,439 0 0 0 0 1 texapon 1 0,167 -6,72 15,4 475,138 0 0 0 0 1 texapon 1 0,132 0 25,3 565,517 0 0 0 0 1 texapon 1 0,287 -3,36 12,2 110,345 1 1 0 0 0 texapon 1 0,140 30,24 74,8 514,286 0 0 0 0 1

asam

salisilat 0 0,219 0 81,4 197,094 0 0 0 1 0 asam

salisilat 0 0,250 -6,72 30,8 34,783 1 0 1 0 0 asam

salisilat 0 0,147 -20,2 22 27,329 0 0 0 1 0 asam

salisilat 0 0,241 0 39,6 169,381 0 0 0 1 0 asam

salisilat 0 0,140 3,36 33 169,381 0 0 0 1 0 asam

salisilat 0 0,122 0 22 397,79 0 0 0 1 0 asam

salisilat 0 0,164 -3,36 22 468,965 0 0 0 1 0 asam

salisilat 0 0,231 -6,72 17,6 124,138 0 0 0 1 0 asam

salisilat 0 0,274 0 9,9 96,552 1 0 1 0 0 fase air 1 0,248 -3,36 31,9 48,01 1 1 0 0 0 fase air 1 0,257 -3,36 13,2 0 1 1 0 0 0 fase air 1 0,253 -26,9 18,7 17,391 1 1 0 0 0 fase air 1 0,245 -6,72 18,6 130,293 1 1 0 0 0 fase air 1 0,242 3,36 26,4 117,264 0 0 0 0 1 fase air 1 -0,116 3,36 18,7 430,939 0 0 0 0 1 fase air 1 0,296 -3,36 23,1 579,31 1 1 0 0 0 fase air 1 0,283 -3,36 25,3 0 1 1 0 0 0 fase air 1 0,202 3,36 67,1 41,558 0 0 0 0 1 air 0 0,167 6,72 12,1 96,02 0 0 0 1 0 air 0 0,178 0 8,8 0 0 0 0 1 0 air 0 -0,251 -3,36 7,7 19,875 0 0 0 1 0 air 0 -0,137 0 9,9 130,293 0 0 0 1 0 air 0 -0,217 -3,36 7,7 91,205 0 0 0 1 0 air 0 -0,201 0 6,6 364,641 0 0 0 1 0 air 0 -0,194 3,36 9,9 496,552 0 0 0 1 0 air 0 -0,227 -6,72 15,4 96,552 0 0 0 1 0 air 0 -0,244 3,36 2,2 -7,792 0 0 0 1 0 11 6 39 7

Lampiran 8. Hasil Classification and Regression Tree metode class

BIOGRAFI PENULIS

Penulis Skripsi yang berjudul “VALIDASI PROTOKOL SLUG

IRRITATION TEST PADA SEDIAAN

LOTION

REPELAN

MINYAK

PEPPERMINT

(

Mentha

piperita

)

DENGAN

METODE

CLASSIFICATION AND REGRESSION TREES

(CART)” bernama lengkap Elisabeth Indah Susanto, lahir di

Sleman pada tanggal 29 Juli 1994, merupakan anak keempat

dari empat bersaudara pasangan Bapak St. Aris Susanto dan Ibu

Indriyanti S

and

jojo, memiliki tiga orang kakak laki-laki

bernama Nicholas Adi Perdana Susanto, Christian Adi Susanto, dan Robby Triadi

Susanto. Penulis menempuh pendidikan formal di TK Budya Wacana Jogjakarta

pada tahun 1997-1999, SD Budya Wacana Jogjakarta pada tahun 1999-2005,

SMP N 1 Jogjakarta pada tahun 2005-2008, SMA N 9 Jogjakarta pada tahun

2008-2011. Pada tahun 2011 penulis melanjutkan studi di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Jogjakarta dan menyelesaikannya sampai dengan

tahun 2015. Selama kuliah penulis pernah menjadi asisten Praktikum Kimia Dasar

(2012), Praktikum Kimia Organik (2013), Praktikum Farmasi Fisika (2013, 2015),

dan Praktikum Biofarmasetika (2015).