17
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian dengan judul “Uji In Vivo Validasi Protokol Slug Irritation Test pada Sediaan Lotion Repelan Minyak Peppermint Mentha piperita
menggunakan metode Classification and Regression Trees CART” merupakan jenis penelitian eksperimental semu quasi-experimental pada uji
in vivo slug irritation test dan eksploratif pada validasi protokol slug irritation test dengan model prediksi yang dikembangkan menggunakan metode
statistika classification and regression tree CART.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel utama
a. Varibel bebas. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah zat uji
yang iritattasi. b.
Variabel tergantung. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah respon iritatif yang dilihat dari jumlah produksi mukus,
pengukuran protein, LDH, dan ALP.
2. Variabel pengacau
a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam
penelitian ini adalah berat berat siput yang digunakan untuk slug irritation test 3-4 g.
b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali
dalam penelitian ini adalah umur dan kondisi patologis siput
3. Definisi Operasional
a. Minyak pepper mint merupakan minyak yang berasal dari Mentha
piperita dan diperoleh dengan cara destilasi uap. b.
Lotion merupakan emulsi encer yang berefek lubrikan dan didesain untuk pemakaian luar.
c. Siput atau slug merupakan jenis hewan non-vertebrata, tanpa
cangkang dari spesies Laevicaulis alte FéR, dipilih yang sudah dewasa, memiliki mantel berwarna hitam, tidak boleh coklat
ataupun bertotol, memiliki berat 3-4 g. Sehat secara fisik, tidak ada luka, tidak berlendir, dan aktif bergerak.
d. Iritasi adalah kondisi pada kulit yang terjadi akibat kontak dalam
jangka panjang dengan bahan kimia tertentu. e.
Mukus adalah lendir yang diproduksi oleh siput.
C. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah glassware Pyrex
®
, cawan porselin, pengaduk, thermometer, timbangan analitik Mettler Toledo
®
, horizontal double plate, stopwatch, hand mixer, cawan petri, pinset, mikropipet, labu ukur 5 mL, pipet tetes, mikro tube
Effendrorf
®
, Spektofotometer UV-VISIBLE tipe UV mini-1240 Shimadzu
®
di Laboratorium Kimia Fisika Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
2. Bahan
Bahan yang digunakan minyak peppermint, Virgin Coconut Oil
VCO, Tween 40, Span 80, asam stearat, gliserin, trietanolamin, cetyl alcohol, akuades, asam salisilat, arbutin, SLS, dan Phospate Buffer
Salin PBS.
3. Reagen
a. Reagen Albumin. Reagen albumin yang digunakan adalah reagen
Albumin ReiGed Diagnostics
®
. Komposisi dan konsentrasi dari reagen untuk penetapan kadar albumin disajikan pada Tabel I.
Tabel I. Komposisi dan konsentrasi reagen Albumin
Komposisi Konsentrasi mM
Bromcresol green 0,25
Succinat Buffer 85
Surfactant pH 4,20 ± 0,1
b. Reagen LDH. Reagen LDH yang digunakan adalah reagen LDH
FS-DGKC DiaSys
®
. Komposisi dan konsentrasi dari reagen untuk penetapan kadar LDH disajikan pada Tabel II.
Tabel II. Komposisi dan konsentrasi reagen LDH
Komposisi pH Konsentrasi mmol L
R1 Phospate buffer 7,5
64 Pyruvate
0,80 R2
Good’s buffer 9,6
NADH 1,0
c. Reagen ALP. Reagen ALP yang digunakan adalah reagen ALP
ReiGed Diagnostics
®
. Komposisi dan konsentrasi dari reagen untuk penetapan kadar ALP disajikan pada Tabel III.
Tabel III. Komposisi dan konsentrasi reagen ALP
Komposisi Konsentrasi mM
Reagen 1 Diethanolamine
1,0 Magnesium chloride
0,5 Reagen 2
p- Nitrophenylphosphatase pH 10,4 ± 0,2
10,0
4. Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah siput tanpa cangkang berwarna hitam dengan spesies Laevicaulis alte FéR
dengan berat badan 3-4 g. Siput diperoleh dari daerah Ungaran, Jawa Tengah.
D. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan Lotion repelan minyak peppermint
a. Pemilihan Formula
Formula yang digunakan mengacu pada formula Elisabeth Dea 2012. Formula yang digunakan pada penelitan ini adalah:
RVirgin coconut oil 6 g
Tween 40 4 g
Span 80 4 g
Asam stearat 2,74 g
Gliserin 15 g
TEA 0,15g
Cetyl alcohol 0,5 g
Minyak peppermint 1,74 g
Akuades ad 32 g
b. Formula Kontrol Positif Dan Negatif
Tabel IV. Formula Kontrol Positif dan Negatif
Bahan Fase
mi- nyak
g Fase
air g
Basis lotion
g Asam
salisi- lat
0,5 g
SLS 1 g
Arbu -tin
5 g
Aqua -dest
g
VCO 6
- 6
6 6
6 -
Tween 40 4
- 4
4 4
4 -
Span 80 4
- 4
4 4
4 -
Asam stearat
2,74 -
2,74 2,74
2,74 2,74
- Gliserin
- 15
15 15
15 15
- TEA
0,15 -
0,15 0,15
0,15 0,15
- Cetyl
alcohol 0,5
- 0,5
0,5 0,5
0,5 -
Akuades -
32 32
32 32
32 32
Asam salisilat
- -
- 0,32
0,644 3,22
- Sifat
bahan Non-
iritan Iritan
Non- iritan
Non- iritan
Iritan Non-
iritan Non-
iritan
c. Pembuatan Lotion Repelan
Semua bahan dipanaskan di atas waterbath. 1 Setelah meleleh asam stearat, cetyl alcohol, dan span 80 dicampur,
ditambahkan dengan TEA, aduk hingga homogen. 2 VCO dan tween 40 dicampur dan diaduk hingga homogen. 3 Campuran
nomor 1 dan nomor 2 dicampur dan diaduk hingga homogen.
4 Gliserin dan 13 akuades dicampurkan, aduk hingga homogen. Campuran nomor 3 diaduk dengan mixer dengan kecepatan 1
selama 5 menit. Pada menit ke-5 campuran nomor 4 dimasukkan, kemudian 23 sisa akuades dimasukkan secara perlahan. Pada 30
detik terakhir, minyak peppermint dimasukkan, aduk hingga homogen.
2. Uji sifat fisis sediaan lotion repelan minyak peppermint
a. Uji Daya Sebar
Uji daya sebar dilakukan setelah 48 jam pembuatan sediaan lotion dengan menimbang sebanyak 1 g dan diletakkan di atas
kaca berbentuk bulat berskala dan ditutup dengan kaca bulat penutup. Kaca bulat tersebut diberi beban 125 g dan didiamkan
selama 1 menit, serta diukur daya penyebarannya. b.
Uji Viskositas Uji viskositas dilakukan setelah 48 jam pembuatan sediaan
lotion menggunakan viskometer Rion. 3.
Pembuatan bahan uji iritasi dalam basis lotion Semua bahan dipanaskan di atas waterbath. 1 Setelah meleleh asam
stearat, cetyl alcohol, dan span 80 dicampur, ditambahkan dengan TEA, aduk hingga homogen. 2 VCO dan tween 40 dicampur dan diaduk hingga
homogen. 3 Campuran nomor 1 dan nomor 2 dicampur dan diaduk hingga homogen. 4 Gliserin dan 13 akuades dicampurkan, aduk hingga
homogen. Campuran nomor 3 diaduk dengan mixer dengan kecepatan 1
selama 5 menit. Pada menit ke-5 campuran nomor 4 dimasukkan, kemudian 23 sisa akuades dimasukkan secara perlahan. Pada 30 detik
terakhir, asam salisilat sls arbutin dimasukkan, aduk hingga homogen. 4.
Pengumpulan dan Determinasi Siput Siput diperoleh dari wilayah Perumda, Ungaran-Kabupaten Semarang.
Determinasi dilakukan di Laboratorium Taksonomi Hewan Universitas Gajah Mada. Siput yang diperoleh dibedah, dilihat bentuk alat
reproduksinya, dan disesuaikan dengan literatur. 5.
Slug Irritation test Uji iritasi menggunakan slug irritation test diadaptasi dari prosedur uji
Slug Mucosal Test Adriens, 2006. Uji iritasi dievaluasi dengan menempatkan siput pada bahan uji dalam periode waktu 60 menit dan
diukur jumlah lendir yang diproduksi. Masing-masing siput dan cawan petri ditimbang. Bahan uji ditimbang 1 g, dimasukkan ke dalam cawan
petri, kemudian siput diletakkan di atas bahan uji dan ditunggu selama 60 menit. Setelah kontak selama 60 menit,
kemudian hitung jumlah mukus yang terbentuk. Siput kemudian dipindah ke cawan petri baru, kemudian
diberikan 1 mL PBS di dekat bagian bawah tubuh siput dan didiamkan selama 60 menit. Bahan uji yang menyebabkan kerusakan jaringan akan
menghasilkan pelepasan biomarker ke PBS, sehingga protein dan enzim dapat diukur dalam sampel PBS. protein dan enzim yang dikeluarkan
laktat dehidrogenase LDH dan alkali fosfatase ALP dari dinding
tubuh siput dapat diukur. Kemudian sampel diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
6. Pengukuran ALP
Mukus yang diproduksi setelah ditambahkan PBS diambil 20 µL, dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL. Ditambahkan reagen pertama
Tabel III sebanyak 800 µL dan reagen kedua Tabel III sebanyak 200 µL. Kemudian aquades ditambahkan hingga 5 mL dan didiamkan selama 3
menit. Pengukuran absorbansi dilakukan kembali pada waktu 4, 5, dan 6 menit. Absorbansinya dengan spektrofotometer UV dengan panjang
gelombang 405 nm. 7.
Pengukuran LDH Mukus yang diproduksi setelah ditambahkan PBS diambil 20µ l,
dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL. Ditambahkan reagen pertama Tabel IIsebanyak 800 µ dan reagen kedua Tabel II 200 µL. Kemudian
aquades ditambahkan hingga 5 mL dan didiamkan selama 1 menit. Pengukuran absorbansi dilakukan kembali pada waktu 2, 3, dan 4 menit.
Absorbansinya dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 340 nm.
8. Pengukuran kadar albumin
Mukus yang diproduksi setelah ditambahkan PBS diambil 8 µl, ditambahkan
dengan 800 μL reagen albumin Tabel I. Ditambahkan 3200 μL akuades. Absorbansi senyawa dibaca pada panjang gelombang 630 nm.
E. Analisis Hasil
Kategori