Ukuran keseluruhan kolom sungguh beragam, tetapi biasanya panjangnya sekurang-kurangnya 10 kali garis tengah dalamnya dan mungkin saja sampai 100
kalinya. Ukuran kolom dan banyaknya penjerap yang dipakai ditentukan oleh bobot campuran sampel yang akan dipisahkan.
Untuk pemisahan normal, bobot sampel biasanya 30:1 ternyata memadai jika pemisahan tidak terlalu sukar. Ukuran partikel penjerap pada kolom biasanya lebih
besar daripada untuk KLT. Walau pun banyak jenis penjerap telah dipakai untuk kolom, alumina dan silika gel adalah penjerap yang paling berguna dan mudah
didapat. Fraksi kolom yang mengandung senyawa yang sama diperiksa dengan KLT
atau tampaknya berasal dari satu puncak memakai pendeteksian sinambung digabungkan, dan pelarutnya diuapkan, lebih baik dengan tekanan rendah. Jika pelarut
dan penjerap murni. Maka fraksi-fraksi pun murni Gritter dkk, 1991.
2.6 Teknik Spektroskopi
Teknik analisis modern mencakup berbagai teknik analisis instrumen elektronika yang dikembangkan untuk mengukur parameter fisika dan kimia alami yang khas dan tetap
dari atom atau molekul. Parameter khas yang bermakna untuk analisis adalah absorpsi dan emisi energi radiasi elektromagnet oleh atom atau molekul. Teknik analisis
spektroskopi berasaskan antaraksi radiasi elektromagnet dengan komponen atom atau molekul yang menghasilkan fenomena bermakna sebagai parameter analisis.
Karena pada setiap teknik spektroskopi antaraksi radiasi elektromagnet dengan komponen atom molekul khas dan tidak semuanya sama, uraian teknik
analisis didahului dengan mekanisme antaraksi tersebut, serta fenomena yang dipakai sebagai parameter analisisnya Satiadarma dkk, 1995.
2.6.1 Spektroskopi Ultraviolet UV-Vis
Senyawa polifenol memiliki dua karakteristik pita penyerapan Ultraviolet dengan maksimal jarak 240 sampai 285 nm dan 300 sampai 550 nm. Berbagai macam
golongan flavonoid dapat dikenali dari spektrum UV mereka masing-masing, karakteristik spektra UV.
Universitas Sumatera Utara
Dari masing-masing flavonoid yang mengandung jumlah dari golongan hidroksil aglikon, pola substituen glikosida, dan golongan asil aromatik bahan
alam.Saat ini penggunaan Spektroskopi UV-Visible paling sering digunakan dalam aplikasi untuk analisa kuantitatif, dan nilai dari metode ini dapat mengurangi
perbandingan informasi yang banyak dari teknik spektroskopi yang lainnya seperti NMR dan MS Anderson, 2006.
Spektrum flavonoid biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut metanol MeOH, AR atau yang setara atau etanol EtOH, meski perlu diingat bahwa
spektrum yang dihasilkan dalam etanol kurang memuaskan sehingga pada umumnya pelarut metanol yang digunakan untuk menentukan serapan pita yang
dihasilkan.Perubahan penyulihan pada cincin A cenderung tercerminkan pada serapan pita II, sedangkan perubahan penyulihan pada cincin B dan C cenderung lebih jelas
tercermin pada serapan pita I Markham, 1988. Ciri spektrum khas jenis flavonoid utama dengan pola oksigenasi yang setara
disajikan pada tabel 2.2 dibawah ini:
Tabel 2.2 Rentangan Serapan Spektrum UV-Visible golongan Flavonoida No
Pita II nm Pita I nm
Jenis Flavonoida 1
250-280 310-350
Flavon 2
250-280 330-360
Flavonol 3-OH tersubstitusi 3
250-280 350-385
Flavonol 3-OH bebas 4
245-274 310-330 bahu
Isoflavon 5
275-295 300-330 bahu
Flavanon dan dihidroflavonol 6
230-270 kekuatan rendah
340-390 Khalkon
7 230-270
kekuatan rendah 380-430
Auron
8 270-280
465-560 Antosianidin dan antosianin
Markham, 1988
Universitas Sumatera Utara
2.6.2 Spektroskopi Inframerah FT-IR
Spektrum inframerah suatu molekul adalah hasil transisi antara tingkat energi getaran vibrasi yang berlainan. Inti-inti atom yang terikat oleh ikatan kovalen mengalami
getaran vibrasi atau osilasi oscillation dengan cara serupa dengan dua bola yang terikat oleh suatu pegas.
Bila molekul menyerap radiasi inframerah, energi yang diserap menyebabkan kenaikan dalam amplitudo getaran atom-atom yang terikat itu. Jadi molekul ini berada
dalam keadaan vibrasi tereksitasi , energi yang diserap ini akan dibuang dalam bentuk panas bila molekul itu kembali ke keadaan dasar. Panjang gelombang eksak dari
absorpsi oleh suatu tipe ikatan, bergantung pada macam getaran dari ikatan tersebut. Oleh karena itu, tipe ikatan yang berlainan C-H, C-C, C=O, C=C, O-H, dan
sebagainya menyerap radiasi inframerah pada panjang gelombang yang berlainan. Dengan demikian spektrometri inframerah dapat digunakan untuk mengidentifikasi
adanya gugus fungsi dalam suatu molekul. Banyaknya energi yang diserap juga beraneka ragam dari ikatan ke ikatan. Ini disebabkan sebagian oleh perubahan dalam
momen dipol µ≠0 pada saat energi diserap. Ikatan nonpolar seperti C-H atau C-C menyebabkan absorpsi lemah, sedangkan
ikatan polar seperti misalnya O-H, N-H, dan C=O menunjukkan absorpsi yang lebih kuat.
Suatu ikatan dalam sebuah molekul dapat mengalami berbagai vibrasi molekul. Secara umum terdapat dua tipe vibrasi molekul:
1. Streching vibrasi regangulur: vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi perpanjangan atau pemendekan ikatan.
2. Bending vibrasi lenturtekuk: vibrasi yang disebabkan oleh sudut ikatan sehingga terjadi pembesaran atau pengecilan sudut ikatan.
Oleh karena itu suatu ikatan tertentu dapat menyerap energi lebih dari satu panjang gelombang. Contohnya, ikatan O-H menyerap energi pada frekuensi 3330 cm
-1
, energi pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi regang ikatan O-H itu.
Suatu ikatan O-H itu juga menyerap pada kira-kira 1250 cm
-1
, energi pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi lentur. Tipe vibrasi yang berlain-lainan
ini disebut cara vibrasi fundamental Supratman, 2010.
Universitas Sumatera Utara
2.6.3 Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton
