BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat-alat
1. Spektrofotometer
1
H-NMR JeolDelta2NMR 500MHz
2. Spektrofotometer FT-IR
Shimadzu 3.
Spektrofotometer UV-Vis Bűchi R-114
4. Rotarievaporator
5. Labu rotarievaporator 1000 mL
Schoot Duran 6.
Ekstraktor 5000 mL
Schoot Duran 7.
Tabung reaksi Pyrex
8. Kolom kromatografi 9. Neraca analitis
Mettler AE 200 10. Lampu UV
11. Corong kaca 12. Corong pisah
500 mL Pyrex
13. Alat destilasi 14. Labu takar
250 mL Pyrex
15. Pipet tetes 16. Botol vial
15 mL 17. Pipa Kapiler
18. Spatula 19. Statif dan klem
20. Penangas air 21. Batang pengaduk
22. Chamber 23. Gelas ukur
Pyrex 24. Gelas Beaker
Pyrex 25. Gelas Erlenmeyer
Pyrex
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan-bahan
1. Biji Buah Pinang
2. Metanol
Destilasi 3.
Etil asetat Teknis
4. Aquadest
5. N-heksana
Teknis 6.
Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck 7.
FeCl
3
5 8.
NaOH 10 9.
Serbuk Mg 10. HCl
p
11. H
2
SO
4p
12. Pereaksi Benedict 13. HCl 6
14. Kapas 15. Kloroform
Teknis 16. Plat KLT silika gel 60 F
254
E.Merck.Art 554
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah buji buah pinang yang diambil dari area Marihat Mayang Kecamatan Hutabayu, Kabupaten Simalungun, Sumatera Utara.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Biji Buah Pinang
Serbuk biji bauh pinang diidentifikasi dengan menggunakan cara Skrining Fitokimia. Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam biji buah pinang
maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
1. Dimasukkan 10 gram serbuk biji buah pinang yang telah dikeringkan ke dalam dua gelas Erlenmeyer
2. Ditambahkan 100 mL metanol ke dalam gelas Erlenmeyer 3. Didiamkan selama 1 malam
4. Disaring 5. Dibagi masing-masing ekstrak sampel ke dalam 4 tabung reaksi
6. Ditambahkan masing-masing pereaksi a. Tabung I : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan serbuk Mg, dan HCl
p
menghasilkan larutan merah jambu c. Tabung III: dengan NaOH 10 menghasilkan larutan hijau kekuningan
d. Tabung IV: dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan orange kekuningan
3.3.3 Ekstraksi Biji Buah Pinang
Serbuk biji buah pinang ditimbang sebanyak 2000 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 7 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam.
Maserasi ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut
metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan tanin dengan cara melarutkan fraksi pekat metanol dengan etil asetat, dan disaring.
Filtrat kemudian di rotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan di
ekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-heksana sampai lapisan n-heksana hampir bening. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali
dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ektrak pekat lapisan metanol.
Fraksi metanol di uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict, lalu di hidrolisis dengan menggunakan HCl 6 sambil di panaskan diatas penangas air
selama ± 45 menit jam. Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh di ektraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali. Ekstrak kloroform dipekatkan dengan
rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 0,65 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fase diam silika gel 60F
254
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom. Fasa
gerak yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 vv.
Dimasukkan 10 ml campuran larutan fase gerak n-heksana: etil asetat 90:10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Di totolkan ekstrak pekat
kloroform pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu di tutup dan di elusi.
Plat yang telah di elusi, di keluarkan dari bejana, lalu di keringkan. Di amati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi dengan
pereaksi FeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana:etil
asetat dengan perbandingan 80:20, 70:30, 60:40 vv.
3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40
70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n- heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 vv.
Dirangkai alat kromatografi kolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen
lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dibuburkan 0,65
g ekstrak pekat kloroform dengan silika gel dengan pelarut kloroform. kemudian dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur
silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat 90:10 vv secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama
banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas.
Universitas Sumatera Utara
Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20 vv, 70:30 vv, dan 60:40 vv. Hasil yang diperoleh
ditampung dalam botol vial setiap ± 10 mL, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama.
3.3.6 Pemurnian
Amorf yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan etilasetat secara perlahan-lahan, larutan bagian atas didekantasi dan
dimasukkan kedalam botol vial. Kemudian diuapkan larutan sampai 23 volume. Didiamkan dan dibiarkan menguap dengan menutup botol vial menggunakan
alluminium foil yang telah diberi lubang dan dibiarkan pada ruang tertutup pada suhu kamar. Kristal yang diperoleh kemudian dikristalisasi kembali dengan etil asetat
Jacobs, 1974.
3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana:etil asetat 70:30 vv, dan kloroform:metanol 80:20 vv.
Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi lapis tipis, lalu dijenuhkan. Ditotolkan pasta yang sebelumnya dilarutkan dengan kloroform
pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi lapis tipis yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat
KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi 3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Kimia Organik FMIPA UGM Lampiran Gambar 4.1
Universitas Sumatera Utara
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia
– LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan KBr Lampiran Gambar 4.2.
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H- NMR
Analisis dengan alat Spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia
– LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan Aseton sebagai pelarut Lampiran Gambar 4.3.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
10 gram Serbuk biji buah pinang Areca catechu L
diekstraksi dengan metanol disaring
diuji dengan pereaksi falvonoida
Tabung I Tabung II
ditambahkan pereaksi
FeCl
3
5 diamati
perubahan warna
ditambahkan pereaksi
Mg-HCl diamati
perubahan warna
Larutan Hitam
Positif Flavonoida Larutan
merah muda Positif Flavonoida
dipekatkan
Universitas Sumatera Utara
3.5 Bagan Penelitian
2000gram serbuk biji buah pinang Areca catechu L
diskrining fitokimia
dimaserasi dengan metanol sebanyak 5 L
didiamkan selama ± 24 jam dilakukan sebanyak 6 kali
disaring Ekstrak metanol
Residu diskrining fitokimia
Ekstrak pekat metanol diuapkan hingga semua metanol menguap
dilarutkan dengan etil asetat disaring
Ekstrak etil asetat Endapan
diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak pekat etil asetat diuapkan hingga semua etil asetat menguap
dilarutkan dengan metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai bening
Lapisan metanol Lapisan n-heksana
diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator
diuapkan hingga pekat dilakukan uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict +
dihidrolisis dengan HCl 6 sambil dipanaskan selama 45 menit didinginkan
disaring Ekstrak metanol asam
Residu diekstraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali
Lapisan kloroform
Lapisan metanol asam
dipekatkan Ekstrak pekat kloroform
dipekatkan dengan rotarievaporator
diskrining fitokimia
Universitas Sumatera Utara
Lanjutan
Ekstrak pekat kloroform diskrining fitokimia
diuji Kromatografi Lapis Tipis untuk mengetahui eluen yang sesuai dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak eluen
n-heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40vv ditampung tiap fraksi sebanyak ± 10 mL dalam botol vial
digabung fraksi dengan Rf yang sama diuji Kromatografi Lapis Tipis
Fraksi 20-25 90:10
Fraksi 40-50 80:20
Fraksi 55-75 70:30
Fraksi 80-95 60:40
diuji FeCl
3
5
Hasil Isolasi dianalisis Kromatografi
Lapis Tipis ditimbang massanya
dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis,
spektrofotometer Infram merah FT-IR,
spektrometer
1
H-NMR Hasil Analisis
diuji FeCl
3
5 diuji
FeCl
3
5 diuji
FeCl
3
5
Hasil Negatif
Hasil Positif
Hasil Positif
Hasil Positif
Rekristalisasi
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Peneltian
Kategori