Sel eritrosit yang telah mengendap di dasar tabung kemudian ditambahkan kembali dengan larutan PBS. Suspensi eritrosit kemudian
diencerkan agar jumlah sel dapat dihitung. Pengenceran dilakukan sebanyak 300 kali dan jumlah sel dihitung, sel yang hidup harus lebih dari
95 agar dapat dipergunakan untuk pengujian hemolisis sel eritrosit. Perhitungan jumlah sel hidup di atas 95 dilakukan dengan
hemasitometer dan larutan pewarna trifan biru.
Gambar 9. Hasil pemisahan sel eritrosit menggunakan Hystopaque
4. Pengujian Respons Perlindungan Eritrosit Terhadap Hemolisis Qin Yan Zhu, 2002
Suspensi sel eritrosit yang hidup di atas 95 disiapkan. Suspensi sel tersebut kemudian ditambahkan ke dalam sumur sebanyak 60
μl. Kemudian, ke dalam tiap – tiap sumur tersebut ditambahkan ekstrak
sebanyak 20 μl yang telah disiapkan. Ekstrak yang telah disiapkan tersebut
terdiri dari tiga taraf, yaitu C1, C2, dan C3. Well yang telah berisi suspensi eritrosit dan ekstrak tersebut kemudian didiamkan selama 10 menit pada
inkubator bersuhu 37°C agar ekstrak dapat bercampur seluruhnya dengan suspensi eritrosit.
Sel eritrosit Sel limfosit
Suspensi eritrosit dan ekstrak tersebut kemudian ditambah dengan larutan H
2
O
2
0.5 atau formaldehida 5 sebanyak 20 μl untuk memicu
terjadinya hemolisis. Kontrol negatif yang digunakan adalah suspensi eritrosit yang hanya ditambahkan larutan oksidator. Larutan Phosphat
Buffered Saline digunakan untuk menyamakan volume dari masing- masing suspensi dalam sumur. Volume dari masing-masing suspensi
dalam sumur adalah 100 μl. Dilakukan 3 ulangan pada masing-masing
suspensi yang hendak diukur absorbansinya. Inkubasi dilakukan dalam inkubator bersuhu 37°C selama 2 jam.
Pengukuran dilakukan setiap 20 menit sekali dengan menggunakan Spectrophotometer Micropalate Reader pada panjang gelombang 450 nm.
Pencegahan Hemolisis = Abs. Kontrol Negatif – Abs. Sampel Abs. Kontrol Negatif
Keterangan : Abs. Kontrol Negatif : Absorbansi suspensi eritrosit + oksidator
Abs. Sampel : [Absorbansi suspensi eritrosit + hasil ekstraksi +
oksidator-Absorbansi hasil ekstraksi] X 100
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Ekstraksi
Tahap ekstraksi dilakukan dengan menggunakan dua pelarut, yaitu akuades dan etanol 96 . Ekstraksi dilakukan pada daun ceremai, delima
putih, jati belanda, dan kemuning, sedangkan pada kecombrang, ekstraksi dilakukan pada bunganya. Bagian tanaman tersebut merupakan bagian
tanaman yang umum untuk dikonsumsi oleh masyarakat secara tradisional. Proses ekstraksi harus dilakukan dengan menggunakan pelarut yang
sesuai. Pelarut polar digunakan untuk mengekstrak komponen polar pula, dan sebaliknya. Selain itu, rasio pelarut dan sampel yang hendak diekstrak, suhu
yang digunakan selama proses ekstraksi, serta lamanya proses ekstraksi juga turut menentukan hasil yang didapatkan selama proses ekstraksi.
Akuades digunakan sebagai pelarut karena umum digunakan dalam proses ekstraksi pada kehidupan sehari-hari. Sedangkan pelarut etanol
digunakan karena memiliki polaritas lebih tinggi daripada aquades sehingga diharapkan lebih banyak melarutkan komponen polar. Umumnya, komponen
terlarut yang dapat diperoleh dengan menggunakan pelarut akuades atau etanol adalah komponen fenolik Shahidi et.al., 1995.
Menurut Shahidi 1995, pelarut yang sering digunakan untuk proses ekstraksi polifenol meliputi metanol, etanol, aseton, air, etil asetat, propanol,
dimetilformamide, dan kombinasi antara pelarut-pelarut tersebut. Kelarutan polifenol diatur oleh tipe pelarut yang digunakan, derajat polimerisasi fenolik,
interaksi komponen fenolik dengan komponen lainnya dalam sampel yang memungkinkan terjadinya kompleks yang tidak larut. Etanol dan air
digunakan untuk mengekstrak suatu bahan yang belum diketahui kandungan kimianya secara jelas untuk alasan keamanan Depkes, 2000. Walaupun
begitu, belum ada pelarut yang cocok digunakan untuk isolasi seluruh kelas atau kelas yang spesifik saja dari komponen fenolik Shahidi et.al., 1995.
Proses ekstraksi sampel dilakukan dalam keadaan basah, artinya sampel tidak mengalami proses pengeringan terlebih dahulu, mengikuti proses
ekstraksi yang dilakukan oleh masyarakat secara tradisional. Perbandingan
