2.3. Analisis Total Fenol Analisis terhadap total fenol sampel dilakukan menurut
metode Chandler dan Dodds yang dimodifikasi Shetty et.al , 1995. Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang
telah berisi 1 ml etanol 95 dan 5 ml air bebas ion. Pereaksi Folin- Ciocalteau 50, 0,5 ml ditambahkan pada masing-masing sampel.
Campuran tersebut kemudian divorteks dan didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit, ditambahkan 1 ml Na
2
CO
3
5 , kemudian divorteks dan disimpan selama 60 menit dalam ruang gelap. Sampel
dihomogenisasi kembali, dan absorbansinya diukur pada panjang gelombang 725 nm. Standar yang digunakan adalah asam tanat.
Dengan konsentrasi 0, 5, 10, 15, 20, dan 25 ppm. 2.4. Analisis Kapasitas Antioksidan Hatano et.al., 1988
Analisis kapasitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode DPPH. Sebanyak 2 ml buffer asetat dicampur
dengan 3.75 ml metanol dan 200 μl larutan DPPH. Campuran
kemudian divorteks. Setelah itu ditambahkan 50 μl sampel larutan
standar. Larutan kemudian divorteks dan didiamkan selama 20 menit di ruang gelap. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang
517 nm. Kontrol negatif yang digunakan adalah metanol, sedangkan kontrol positif yang digunakan adalah asam askorbat 50, 100, 200,
500, dan 1000 ppm. Kapasitas antioksidan diperoleh dengan perhitungan sebagai berikut :
Kapasitas antioksidan = [ A kontrol - – A sampel ] A kontrol -
3. Isolasi Sel Eritrosit Qin Yan Zhu, 2002
Darah donor diambil secara aseptis dan disimpan dalam tabung vacuntee steril yang sudah terdapat EDTA 0.1 . Darah yang diambil
X 100
sebanyak kira-kira 30 ml, dan EDTA 0.1 berfungsi sebagai antikoagulan darah. Pengambilan dilakukan di klinik Farfa, Dramaga,
Bogor oleh seorang suster. Darah tersebut kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifus
steril dan pengerjaannya dilakukan di dalam laminar hood. Darah pada penelitian ini akan digunakan dalam pengujian aktivitas proliferasi dan
aktivitas anti hemolisis. Pemisahan sel eritrosit pada penelitian ini didahului oleh pemisahan sel limfosit untuk digunakan pada pengujian
aktivitas proliferasi. Sampel darah disentrifus selama 10 menit pada 2000 rpm. Sel
eritrosit akan berada di bagian paling bawah dan plasma akan berada di bagian atas. Di antara lapisan sel darah merah dan plasma terdapat lapisan
buffycoat yang sebagian besar merupakan sel limfosit. Lapisan sel eritrosit yang terdapat pada lapisan terbawah tabung sentrifus dapat digunakan
untuk pengujian penghambatan hemolisis. Akan tetapi, pada penelitian ini yang digunakan adalah sel eritrosit yang telah dipisahkan melalui
pemisahan sel limfosit dengan menggunakan Hystopaque. Lapisan buffycoat diambil dengan menggunakan mikropipet.
Lapisan buffycoat yang diambil ini masih mengandung sel eritrosit dan plasma. Kemudian pemisahan sel limfosit dilakukan dengan menggunakan
Histopaque buffycoat : Histoaque = 1:1. Pemisahan dengan Histopaque, yang setelah disentrifus 2500 rpm selama 30 menit, akan mengakibatkan
pemisahan secara utuh antara sel limfosit dan eritrosit. Sel eritrosit akan mengendap di dasar tabung bersama sel lainnya yang mempunyai densitas
cukup tinggi seperti granulosit. Sel eritrosit yang mengendap di bawah dicuci tiga kali dengan
menggunakan larutan PBS Phosphat Buffer Saline lima kali volume sel eritrosit yang diambil. Sebanyak 1 ml sel eritrosit dicuci dengan 5 ml
larutan PBS, kemudian disentrifus 2000 rpm selama 10 menit. Sel eritrosit akan mengendap di dasar tabung dan larutan PBS akan berwarna kuning
jernih. Pencucian dilakukan sebanyak tiga kali hingga larutan PBS hampir tidak berwarna dan jernih.
Sel eritrosit yang telah mengendap di dasar tabung kemudian ditambahkan kembali dengan larutan PBS. Suspensi eritrosit kemudian
diencerkan agar jumlah sel dapat dihitung. Pengenceran dilakukan sebanyak 300 kali dan jumlah sel dihitung, sel yang hidup harus lebih dari
95 agar dapat dipergunakan untuk pengujian hemolisis sel eritrosit. Perhitungan jumlah sel hidup di atas 95 dilakukan dengan
hemasitometer dan larutan pewarna trifan biru.
Gambar 9. Hasil pemisahan sel eritrosit menggunakan Hystopaque
4. Pengujian Respons Perlindungan Eritrosit Terhadap Hemolisis Qin Yan Zhu, 2002
