HASIL DAN PEMBAHASAN
Kegiatan rekayasa genetik tanaman keberhasilannya tergantung pada beberapa hal, diantaranya adalah gen yang akan diintroduksikan, metode
transformasi, sistem regenerasi tanaman dan seleksi, serta ekspresi dari gen yang dimasukkan ke dalam genom tanaman target.Gen asing yang diintroduksikan ke
dalam genom tanaman harus dapat diinsersikan ke genom tanaman, diekspresikan, dan tetap terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel berikutnya Herman
1999.
1. Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY76
Pada penelitian ini, konstruk yang dirakit adalah gen OsWRKY76. Gen ini dipilih berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Ryu et al. 2006, yang
menunjukkan bahwa gen OsWRKY76 adalah salah satu gen-gen yang termasuk keluarga OsWRKY yang memperlihatkan peningkatan ekspresi pada tanaman padi
yang tahan setelah diinokulasi dengan cendawan Pyricularia grisea. Gen OsWRKY76 ini terletak pada segmen di kromosom 9 yang oleh Wisser et al.
2005 diidentifikasi terkait dengan ketahanan penyakit spektrum luas. Pada kegiatan pertama ini dilakukan konstruksi gen kandidat OsWRKY76
di bawah kendali promotor 35SCaMV ke dalam vektor ekspresi pCAMBIA-1301 yang meliputi serangkaian kegiatan yaitu:
1.1. Amplifikasi dan purifikasi fragmen gen OsWRKY76
Penelitian perakitan vektor over-ekspresi diawali dengan mengamplifikasi DNA genom tanaman padi dengan primer untuk gen OsWRKY76 yang telah
didisain sebelumnya, menggunakan mesin PCR. Primer yang didisain menambahkan situs pemotongan enzim restriksi BamHI dan SalI ke produk
amplifikasi pada bagian 5’ dan 3’yang digunakan untuk keperluan ligasi. Penggunaan 2 situs pemotongan enzim restriksi yang berbeda dimaksudkan untuk
memastikan kebenaran arah orientasi dari gen OsWRKY76 pada saat melekat pada promotor dan terminator. Hasil amplifikasi gen OsWRKY76 yang diharapkan pada
tanaman padi varietas Nipponbare adalah ukuran pita sebesar + 1.200 bp Gambar 4.
Gambar 4. Hasil amplifikasi 5 sampel DNA Nipponbare dengan primer untuk gen
OsWRKY76. Ukuran Gen OsWRKY76 yang diharapkan adalah sebesar + 1200 bp ditandai dengan anak panah.
Hasil amplifikasi gen OsWRKY76 dengan ukuran + 1.200 bp tersebut kemudian diisolasi dari gel agarose dengan menggunakan gel extraction kit
Qiagen untuk mendapatkan fragmen gen.
1.2. Kloning gen OsWRKY76 ke dalam vektor kloning
Fragmen gen OsWRKY76 kemudian diligasikan ke dalam plasmid pGEM- T Easy dan ditransformasikan ke E. coli DH5
α dengan metode heat-shock Sambrook et al. 1989. Kegiatan ini dimaksudkan untuk menyimpan,
memperbanyak dan selanjutnya untuk memastikan situs pemotongan yang tepat untuk keperluan kloning pada gen OsWRKY76.
Hasil transformasi plasmid rekombinan ke dalam bakteri E.coli DH5 α
tersebut kemudian ditumbuhkan pada media seleksi LB padat + ampisilin + IPTG dan X-Gal . Antibiotik ampisilin digunakan untuk menyeleksi sel-sel bakteri yang
mengandung plasmid pGEM-T Easy, karena plasmid tersebut mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik ampisilin, sehingga koloni yang tumbuh pada media
seleksi ampisilin dipastikan merupakan koloni bakteri yang mengandung plasmid pGEM-T Easy. Sedangkan larutan IPTG isoprophylthio-beta-D-galactoside dan
X-Gal 5 bromo-4 chloro-3-indolyl- β-D-galactoside digunakan untuk
mendeteksi terjadinya peristiwa komplementasi- α. Dengan adanya IPTG di dalam
1200 bp
DNA Nipponbare Kb
media, akan menginduksi aktivitas enzim β-galactosidase yang dikode oleh gen
Lac Z sehingga mampu menghidrolisismemotong substrat X-Gal sehingga akan memberikan warna biru. Koloni bakteri yang tumbuh apabila berwarna biru
mengindikasikan koloni tersebut hanya mengandung plasmid pGEM-T Easy saja. Warna biru disebabkan adanya ekspresi gen Lac Z yang mengindikasikan bahwa
pada plasmid pGEM-T Easy terjadi religasi. Sedangkan apabila koloni bakteri yang tumbuh berwarna putih, dipastikan plasmid pGEM-T Easy mengandung
insert pada daerah Multi Cloning Sitenya, dimana daerah tersebut memotong gen Lac Z. Oleh karena itu dalam kegiatan ini IPTG dan X-Gal digunakan untuk
menyeleksi koloni bakteri yang mengandung plasmid pGEM-T Easy rekombinan dan koloni bakteri yang mengandung plasmid pGEM-T Easy saja.
Gambar 5. Hasil konfirmasi keberadaan fragmen gen OsWRKY76 pada plasmid pGEM-T
easy yang dipotong dengan enzim BamHI dan SalI, menghasilkan fragmen dengan ukuran + 3.000 bp fragmen pGEM-T Easy dan 1.200 bp fragmen
OsWRKY76 sampel nomor 1, 2, 4, dan 5. Sampel nomor 3 dan 6 menghasilkan ukuran fragmen yang tidak sesuai.
Dari kegiatan transformasi plasmid rekombinan ke dalam bakteri E.coli DH5
α ini didapatkan beberapa koloni bakteri berwarna putih. Dari koloni-koloni tersebut diambil 6 koloni bakteri untuk ditumbuhkan pada medium LB cair yang
mengandung antibiotik ampisilin dan digoyang pada suhu 37
o
C selama semalam, selanjutnya koloni yang tumbuh diisolasi plasmidnya. Untuk konfirmasi
keberhasilan ligasi, plasmid yang telah diisolasi kemudian dipotong menggunakan enzim BamHI dan SalI Gambar 5. Kegiatan ini dilakukan selain untuk
memastikan bahwa plasmid pGEM-T Easy yang diisolasi dari koloni bakteri yang berwarna putih adalah benar merupakan plasmid pGEM-T Easy rekombinan yang
Kb 1 2 3 4 5 6
3.000 bp 1.200 bp
mengandung gen OsWRKY76, juga untuk mendapatkan fragmen gen OsWRKY76 dengan ujung-ujung kohesif hasil pemotongan dengan enzim BamHI dan SalI.
Dari hasil konfirmasi tersebut diperoleh 4 sampel plasmid rekombinan yang menghasilkan ukuran seperti yang diharapkan, yaitu sampel nomor 1, 2 , 4,
dan 5 Gambar 5. Sampel-sampel tersebut menghasilkan produk pemotongan dengan ukuran 3.000 bp yang merupakan ukuran plasmid pGEM-T Easy dan
1.200 bp yang merupakan ukuran dari fragmen gen OsWRKY76. Sampel nomor 3 dan 6 menghasilkan produk pemotongan dengan ukuran yang tidak semestinya,
sehingga plasmid tersebut tidak digunakan untuk penelitian selanjutnya.
1.3. Kloning gen OsWRKY76 ke dalam vektor ekspresi
