selama 30 menit. Membran diinkubasi selama 30 menit dalam 20 mL larutan AP antibody conjugate Anti-dig Roche yang diencerkan 5000x dalam Buffer2.
Untuk menghilangkan kelebihan antibody conjugate, membran diinkubasi selama 2 x15 menit dalam Buffer 1 + SDS, diikuti dengan 2 x 15 menit dalam Buffer1.
Membran diseimbangkan dalam Buffer 3 selama 5 menit. Untuk pendeteksian sinyal dilakukan perendaman membran dalam larutan NBT-BCIP Roche. Enzim
Alkaline Phosphatase AP pada molekul konjugat akan mengkatalisa perubahan substrat NBT-BCIP menjadi senyawa baru yang berwarna biru. Membran
diinkubasi dalam ruang gelap, dan hasilnya dapat dilihat setelah + 30 menit.
3.2. Uji efek over-ekspresi gen OsWRKY76
Tujuan dari kegiatan ini adalah untuk mengetahui apakah introduksi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam genom tanaman dapat
memperbaiki ketahanan tanaman padi Nipponbare terhadap cendawan blas Pyricularia grisea.
Inokulasi cendawan patogen P.grisea dilakukan pada tanaman padi Nipponbare putatif transgenik generasi T1 dan tanaman non-transgenik. Sepuluh
benih dari setiap galur independen tanaman Nipponbare putatif transgenik dengan jumlah kopi tunggal konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 berdasar analisis
Southern Blot dan tanaman non-transgenik ditanam pada bak plastik dengan 3 ulangan. Inokulum cendawan Pyricularia grisea dari isolat uji 173, 033, 133, 041
dan 333 berasal dari konidia tunggal dibiakkan pada media PDA. Infeksi tanaman dilakukan pada tanaman berumur 14 hari setelah tanam dengan cara
menyemprotkan larutan inokulum yang masing-masing mengandung konidia dengan kerapatan 2 x 10
6
konidiaml. Larutan tersebut mengandung Tween 20 dengan konsentrasi 0,05 untuk membantu penempelan konidia pada
permukaan daun. Tanaman yang telah diinokulasi dengan inokulum, kemudian disimpan dalam ruang gelap dengan kelembaban + 98 selama 24 jam.
Kemudian tanaman dipindahkan ke rumah kaca dengan memberi perlakuan kelembaban selama 7 hari. Pengamatan terhadap serangan blas daun dilakukan 1
minggu setelah inokulasi dengan menskoring tipe reaksi penyakit berdasarkan Standard Evaluation System for Rice IRRI 1996 Tabel 2. Analisis statistik uji
T dilakukan untuk membandingkan nilai rata-rata skor tingkat serangan pada masing-masing galur independen dengan 3 ulangan.
Tabel 2. Skala penyakit blas daun berdasarkan sistem evaluasi standar IRRI
Skala Gejala
Tidak ada bercak 1
Bercak kecil berukuran sebesar ujung jarum atau lebih besar dan berwarna coklat, tanpa ada pusat sporulasi
2 Bercak abu-abu berbentuk bundar agak lonjong berdiameter 1-2 mm, memiliki
tepi warna coklat. Umumnya ditemukan pada daun bagian bawah 3
Tipe bercak sama dengan skala 2 tetapi umumnya pada daun bagian atas 4
Bercak khas blas berukuran 3 mm atau lebih panjang, luas daun terinfeksi kurang dari
4 5
Bercak khas blas, luas daun terinfeksi 4-10 6
Bercak khas blas, luas daun terinfeksi 11-25 7
Bercak khas blas, luas daun terinfeksi 26-50 8
Bercak khas blas, luas daun terinfeksi 51-75 dan banyak daun yang mati 9
Lebih dari 75 luas daun terserang
HASIL DAN PEMBAHASAN
1.1. Analisis Integrasi Gen OsWRKY76
