Gambar 11. Hasil konfirmasi pemotongan plasmid pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 yang diisolasi dari E.coli dengan enzim restriksi EcoRI, menghasilkan
fragmen dengan ukuran 210 terminator 35SCaMV, 710 potongan gen OsWRKY76, 1040 potongan gen OsWRKY76 + promotor 35SCaMV, dan
11.837 bp plasmid pCAMBIA-1301.
Dari hasil pemotongan tersebut dihasilkan 4 fragmen baik plasmid yang berasal dari Agrobacterium strain Agl-1 maupun dari EHA 105. Fragmen-fragmen
tersebut masing-masing dengan ukuran 210, 710, 1040, dan 11.837 bp Gambar 11. Ukuran tersebut sesuai dengan peta plasmid yang telah berhasil dikonstruk
Gambar 3. Dengan melihat ukuran fragmen yang dihasilkan tersebut, menunjukkan bahwa transformasi plasmid pCAMBIA- 1301::OsWRKY76 ke
dalam Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 telah berhasil. Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 yang telah mengandung
plasmid pCAMBIA-1301 rekombinan tersebut kemudian akan digunakan untuk kegiatan transformasi pada tanaman padi Nipponbare.
2. Transformasi padi dengan Agrobacterium tumefaciens
Untuk mengetahui ekspresi gen over-ekspresi OsWRKY76 ada hubungannya dengan ketahanan padi terhadap cendawan blas maka pertama-tama
dilakukan introduksi konstruk gen over-ekspresi OsWRKY76 ke dalam genom tanaman padi melalui kegiatan transformasi melalui Agrobacterium tumefaciens.
Alasan penggunaan varietas Nipponbare Japonica adalah karena varietas Nipponbare merupakan tanaman model yang mempunyai kompetensi regenerasi
dan transformasi yang cukup tinggi. Sedangkan metode transformasi mengacu
11.837 bp
1.040 bp 710 bp
210 bp
EHA 105 Agl-1
pada metode Greco et al. 2001 karena metode tersebut telah cukup mapan
digunakan dalam kegiatan transformasi pada tanaman padi Japonica. Kedua
alasan ini akan sangat membantu dan mempermudah di dalam memperoleh
tanaman transgenik.
Dalam proses transformasi Acetosiringon ditambahkan dalam media ko- kultivasi cair dan padat. Acetosiringon merupakan senyawa fenolik yang dapat
menginduksi gen vir sehingga transfer T-DNA ke sel tanaman akan terjadi dan akan membantu meningkatkan transformasi yang stabil Gelvin 2003; Opabode
2006. Dalam media co-cultivasi juga ditambahkan hormon 2,4-D yang berfungsi untuk merangsang pembelahan sel-sel kalus. Pada saat sel aktif membelah
kemungkinan terjadi rekombinasi non-homolog antara T-DNA dan kromosom sel tanaman akan sangat besar, sehingga gen target akan tersisip di dalam genom
tanaman Gelvin 2003. Tabel 1. Hasil transformasi kalus padi varietas Nipponbare dengan konstruk over-
ekspresi gen OsWRKY76 melalui A. tumefaciens strain Agl-1 dan EHA- 105
Strain Agrobacterium
Trans- formasi
ke ∑
kalus ∑ kalus
di media EIM
∑ kalus di media
regenerasi ∑ galur
independen ∑
tanaman
Agl-1 1
277 52 19
31 11,2 27 10
117 2
385 135 35
73 19 71 18
313 3
377 37 10
34 9 2 0,5
2
Total 1039
224 21,6 138 13,3
100 9,6 432
EHA-105 1
370 28 7,5
9 2,4 8 2
15 2
222 31 14
5 2,3 4 2
15 3
417 157 38
14 3,4 14 3
30
Total 1009
216 21,4 28 2,8
26 2,6 60
Ket.: nilai di dalam kurung adalah nilai persentase dari jumlah kalus awal.
Hasil transformasi kalus setelah diperlakukan di media kokultivasi, secara umum dapat dilihat bahwa jumlah kalus dari awal yang dapat lolos sampai ke
tahap regenerasi semakin menurun Tabel 1. Kalus yang tidak tahan pada medium seleksi yang mengandung antibiotik higromisin akan mati, ditunjukkan
dengan kalus berwarna hitam, sedangkan kalus yang tahan pada medium seleksi
akan terus tumbuh, dicirikan dengan terjadinya pertumbuhan kalus yang berwarna putih kekuningan Gambar 12. Kalus yang tidak tahan tersebut tidak
mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 yang ditransfer oleh Agrobacterium. Bagian T-DNA dari plasmid rekombinan yang digunakan untuk
transformasi selain mengandung konstruk gen over-ekspresi OsWRKY76 juga mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik higromisin. Konsentrasi antibiotik
higromisin yang digunakan pada tahap seleksi adalah sebanyak 50 mgL mengikuti yang telah dilakukan oleh Hiei et al. 1994 dan Greco et al. 2001.
Pada media seleksi ini selain ditambahkan antibiotik untuk sel eukariot juga ditambahkan antibiotik untuk mengurangi atau meniadakan kehadiran bakteri. Hal
ini bertujuan untuk mengurangi stres eksplan kalus terhadap over-growth bakteri sehingga dapat melakukan recovery, dan dapat terus berkembang apabila kalus-
kalus tersebut mengandung gen target. Pemberian antibiotik higromisin dilakukan pada setiap tahapan perlakuan, hal ini bertujuan untuk menghindari diperolehnya
transforman yang escape, yaitu transforman yang tumbuh tetapi sebenarnya transforman tersebut tidak mengandung gen yang diinginkan. Higromisin adalah
suatu antibiotik yang dapat membunuh bakteri, fungi dan sel-sel eukariot yang lebih tinggi lainnya karena dapat menghambat sintesis protein.
Dalam penelitian ini digunakan 2 strain Agrobacterium yang dikelompokkan pada strain yang supervirulen yaitu Agl-1 dan EHA 105. Hasil
penelitian selama ini menunjukkan bahwa tingkat virulensi dari strain bakteri Agrobacterium yang digunakan dapat mempengaruhi dalam mendapatkan
transforman. Dengan sifat virulensi strain Agrobacterium yang tinggi diharapkan dapat menginfeksi eksplan lebih kuat dibanding strain kurang virulen. Apabila
dilihat dari nilai efisiensi transformasi yang diperlihatkan dari keberhasilan dalam mendapatkan galur independen, transformasi yang menggunakan strain
Agrobacterium Agl-1 nilai efisiensi transformasi mencapai 9,6 dengan 100 galur independen. Sedangkan transformasi menggunakan strain EHA 105 nilai
efisiensi transformasi mencapai 2,6 dengan 26 galur independen Tabel 1. Hal ini mengindikasikan bahwa strain Agrobacterium Agl-1 lebih kompatibel di
dalam menginfeksi kalus padi Nipponbare dibandingkan dengan strain EHA 105. Dalam tulisannya Opabode 2006 mengutarakan bahwa efisiensi transformasi
sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah faktor Agrobacterium dan jaringan tanaman. Di dalamnya termasuk genotipe, jenis eksplan, vektor
plasmid, strain bakteri, komposisi media kultur, dan pengurangan dari tekanan infeksi Agrobacterium setelah kokultivasi.
Dari hasil pengamatan kalus-kalus yang berhasil lolos di media seleksi dan dipindahkan ke media penginduksian embrio EIM Lampiran 1 akan
membentuk spot hijau pada + 7-21 hari setelah kalus di pindah ke media regenerasi Gambar 12. Kemudian tunas-tunas akan muncul dari spot-spot hijau
tersebut dan akhirnya membentuk tunas. Tunas berukuran + 2 cm dipindahkan ke media perakaran yang mengandung higromisin 40 mgL. Pemindahan ini
bertujuan selain untuk pertumbuhan akar juga untuk seleksi pada tingkat planlet. Planlet transgenik di media perakaran akan membentuk akar secara sempurna dan
akarnya berwarna putih. Namun apabila ada planlet yang escape, maka akar yang tumbuh di media perakaran akan berwarna coklat dan lama-kelamaan planlet akan
mati gambar tidak ditampilkan.
Gambar 12. Hasil transformasi kalus padi Nipponbare melalui Agrobacterium
tumefaciens yang mengandung vector biner pCAMBIA- 1301::35S::OsWRKY76. Ket.: A. kalus pada media seleksi yang
mengandung higromisin 50 mgL, B. kalus yang tumbuh di media EIM induksi embrio yang mengandung antibiotik higromisin 50 mgL, C. kalus
yang berhasil beregenerasi di media regenerasi yang mengandung antibiotik higromisin 30 mgL, D. plantlet di media perakaran yang mengandung
A B
C
D E
antibiotik higromisin 40 mgL, E. populasi tanaman padi Nipponbare transgenik hasil aklimatisasi di rumah kawat.
3. Analisis molekuler tanaman transgenik dengan PCR
