BAHAN DAN METODE
1. Waktu dan Tempat penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rumah Kaca Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
Pertanian BB- BIOGEN di Jl. Tentara Pelajar 3A, Cimanggu, Bogor 16111.
Penelitian ini dilakukan pada bulan September 2006- Oktober 2007. 2. Bahan Penelitian
2.1. Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY76
Bahan penelitian yang digunakan pada pembuatan konstruk vektor over- ekspresi gen OsWRKY76 meliputi : tanaman padi varietas Nipponbare, bahan
isolasi DNA padi, primer spesifik untuk gen OsWRKY76, bahan untuk melakukan PCR, plasmid pGEM-T Easy, enzim restriksi, bahan untuk isolasi plasmid, enzim
T4-DNA ligase, bahan untuk transformasi plasmid ke vektor, elektroforesis, vektor biner pCAMBIA-1301, plasmid pSP13, plasmid pST8, bakteri E. coli
strain DH5 α, bakteri Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105.
2.2. Transformasi padi Nipponbare dengan A. tumefaciens
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah benih padi varietas Nipponbare sebagai sumber eksplan, bahan untuk kegiatan kultur jaringan dan
transformasi, zat pengatur tumbuh, antibiotik dan bakteri Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 rekombinan yang mengandung vektor
over-ekspresi gen OsWRKY76.
2.3. Analisis molekuler tanaman padi transgenik dengan PCR.
Untuk melakukan kegiatan ini bahan yang digunakan adalah DNA padi Nipponbare tipe liar, DNA padi Nipponbare putatif transgenik, bahan untuk
melakukan PCR seperti PCR kit, elektroforesis, primer higromisin.
3. Metode Penelitian
Pada penelitian ini dilakukan 3 rangkaian kegiatan yang berkesinambungan, yaitu perakitan konstruk vektor over-ekspresi gen
OsWRKY76, transformasi padi Nipponbare dengan A. tumefaciens, dan analisis molekuler tanaman padi transgenik dengan teknik PCR Gambar 1.
Gambar 1. Diagram alur penelitian
3.1. Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY76
Tujuan dari kegiatan ini adalah untuk merakit konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam vektor ekspresi.
Prosedur urutan kerja dari kegiatan konstruksi gen OsWRKY76 dimulai dari mendisain primer untuk gen OsWRKY76 dan diakhiri dengan
mengintoduksikan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam A. tumefaciens. Prosedur selengkapnya adalah sebagai berikut Gambar 2:
Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY76
Transformasi padi Nipponbare dengan A. tumefaciens
Analisis molekuler tanaman padi transgenik dengan PCR
LIGASI
Disain primer Isolasi plasmid pSP8, pST13 dan pCAMBIA- 1301 dari E.coli
Amplifikasi gen OsWRKY76 dari
Nipponbare dengan PCR Pemotongan pSP8, pST13 dan pCAMBIA -1301 dengan enzim
restriksi yang sesuai Purifikasi fragmen gen OsWRKY76
dari gel agarose fragmen gen OsWRKY76 Purifikasi fragmen promotor,
terminator danpCAMBIA-13 dari gel agarose
Kloning fragmen ke pGEM-T Easy Pemotongan ujung-ujung fragmen Fragmen promotor, terminator
gen OsWRKY76 dengan enzim restriksi dan pCAMBIA-1301 yang sesuai
Purifikasi fragmen gen OsWRKY76 dari gel agarose
Fragmen gen OsWRKY76 Plasmid pCAMBIA-1301 rekombinan
Hasil ligasi ditransformasi ke E.coli Isolasi plasmid verifikasi plasmid
rekombinan Transformasi ke Agrobacterium tumefaciens
strain Agl-l dan EHA-105
Untuk kegiatan transformasi padi Gambar 2. Bagan alur prosedur kegiatan konstruksi over-ekspresi gen OsWRKY76
Fragmen gen OsWRKY76 di dapatkan dari hasil amplifikasi DNA genom
padi varietas Nipponbare menggunakan primer spesifik yang telah dirancang menggunakan software PRIMER.
Perancangan primer berdasar sekuen DNA genom yang diperoleh dari bank gen melalui perunutan situs di internet
http:www.ncbi.nlm.nih.gov . Pasangan primer yang digunakan adalah : Forward primer = 5’-AATAGGATCCTGGTCGTCGTCGTCGTCGATG-3’ dan
Reverse primer = 5’-AGTCAGTCGACGCTAGAATTCGGGCAGCTTC-3’. Pasangan primer tersebut memasukkan situs pemotongan enzim restriksi BamHI
dan SalI ke produk amplifikasi pada bagian 5’ dan 3’yang digunakan untuk keperluan ligasi.
Reaksi PCR dilakukan dalam 20 ul larutan yang mengandung bahan-bahan sebagai berikut : 2 ul 10x buffer PCR yang mengandung MgCl
2
Roche, 4 ul 5x GC-rich Solution Roche, 0,4 ul dNTPs mix 10 mM Promega, primer
Forward dan Reverse spesifik untuk gen OsWRKY76 masing-masing 0,5 ul 100 ngul , 0,2 ul Enzim Taq-polimerase 5 Uul Fast-startRoche. DNA padi
Nipponbare tipe liar yang diamplifikasi sebanyak 10 l konsentrasi 10 ng l. Reaksi PCR menggunakan mesin PCR PTC-100 MJ Research, Inc.. Profil suhu
yang digunakan adalah predenaturasi pada 94
o
C selama 5 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus denaturasi pada 94
o
C selama 1 menit, penempelan primer pada 55
o
C selama 1 menit, dan pemanjangan pada 72
o
C selama 2 menit. Pada tahap akhir PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72
o
C selama 5 menit. Sebanyak 15 l produk PCR diseparasi dengan teknik elektroforesis pada
gel agarose 1 wv. Hasil amplifikasi gen OsWRKY76 dengan ukuran sekitar 1.200 bp pada gel agarose dipotong dan dipurifikasi dengan menggunakan Gel
Extraction Kit Qiagen mengikuti prosedur yang direkomendasikan oleh perusahaan. Fragmen gen OsWRKY76 tersebut kemudian diligasi ke dalam
plasmid pGEM-T Easy Promega dan ditransformasikan ke dalam E. coli. Koloni hasil transformasi yang tumbuh di media seleksi kemudian ditumbuhkan
di media LB cair dan dilakukan isolasi plasmid dengan metode lisis alkali. Plasmid yang diperoleh kemudian dipotong dengan menggunakan enzim restriksi
BamHI dan SalI. Hasil pemotongan diseparasi dengan elektroforesis dan fragmen
berukuran sekitar 1.200 bp dipurifikasi menggunakan Gel Extraction Kit Qiagen.
Fragmen promoter 35S-CaMV yang berawal dari -526 sampai situs awal transkripsi TTStranscription start site diperoleh sebagai fragmen 0,55 kb
HindIII-BamHI dari turunan pBS-SK+ dari pDH51 Pietrzak et al. 1986. Fragmen terminator 35S-CaMV diperoleh sebagai fragmen 0,21 kb SalI-EcoRI
dari turunan pBS-SK+ dari pDH51 Pietrzak et al. 1986. Plasmid pCAMBIA - 1301 digunakan sebagai vektor biner, yang untuk keperluan ligasi dipotong
dengan enzim restriksi HindIII-EcoRI. Fragmen-fragmen promotor 35S-CaMV, terminator 35S-CaMV, pCAMBIA-1301 dipurifikasi dari gel menggunakan Gel
Extraction Kit Qiagen. Konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 dirakit dengan meligasikan
fragmen-fragmen individual promotor, gen OsWRKY76, dan terminator dengan ujung-ujung kohesif yang kompatibel bersama-sama ke dalam vektor biner dalam
satu reaksi. Plasmid rekombinan tersebut kemudian ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli kompeten yang disiapkan menggunakan CaCl
2
0,1 M dengan metode heat shock Sambrook et al., 1989. Koloni-koloni tunggal yang diperoleh
dari hasil transformasi tersebut kemudian ditumbuhkan dalam media LB cair yang mengandung antibiotik kanamisin 100 mgL dan diisolasi plasmidnya dengan
menggunakan metode lisis-alkali Sambrook et al. 1989. Keberhasilan konstruksi diverifikasi dengan memotong plasmid rekombinan dengan menggunakan enzim
restriksi yang sesuai. Plasmid rekombinan ini kemudian dimasukkan ke dalam Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 dengan metode ‘freeze-
thaw’.
Gambar 3. Skema konstruk 35SCaMV::OsWRKY76::35SCaMV dengan situs pemotongan enzim restriksi dan ukuran dari masing-masing fragmen
RB
OsWRKY76
35SP
35ST
LB
550 bp 490 bp 710 bp 210 HindIIIEcoRI BamHI EcoRI EcoRISalI EcoRI
3.2. Transformasi padi Nipponbare dengan Agrobacterium