Analisis molekuler tanaman transgenik dengan PCR

antibiotik higromisin 40 mgL, E. populasi tanaman padi Nipponbare transgenik hasil aklimatisasi di rumah kawat.

3. Analisis molekuler tanaman transgenik dengan PCR

Untuk mengetahui secara cepat apakah suatu transforman mengandung gen target yang diintroduksikan ke dalam jaringan tanaman, dapat dilakukan analisis menggunakan teknik PCR. Teknik PCR adalah suatu teknik untuk mengamplifikasi sekuaen DNA tertentu dengan menggunakan primer spesifik secara in vitro. Proses PCR melalui suatu rangkaian tahapan reaksi yaitu denaturasi, penempelan primer, dan pemanjangan dari DNA yang berbentuk double helix. Dari reaksi PCR dapat dihasilkan suatu amplikon yang spesifik dengan melihat ukuran dari produk amplifikasi tersebut. Analisis yang terkait dengan pengujian tanaman transgenik dengan memanfaatkan teknik PCR ini hanya dapat menginformasikan keberadaan suatu gen atau sekuen spesifik tertentu di dalam tanaman berdasarkan primer spesifik yang digunakan. Gambar 13. Hasil amplifikasi DNA padi Nipponbare transgenik generasi T0 yang mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 dengan menggunakan primer untuk gen hptII gen untuk ketahanan terhadap antibiotik higromisin. Pita dengan ukuran + 500 bp merupakan ukuran fragmen gen hptII. Ket.: KB=Marker 1 Kb Plus Invitrogen, 1-25= sampel tanaman transgenik generasi T0, Nip=tanaman Nipponbare non- transgenik, A=Air, P=Plasmid pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 Pada penelitian ini dari 126 galur independent tanaman transgenik Nipponbare yang berhasil didapatkan, DNA diisolasi dari daun 25 galur independent tanaman transgenik generasi T0 yang ditransformasi dengan A. 500 bp 500 bp 500 bp KB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 KB 23 24 25 Nip A P KB KB 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 tumefaciens strain Agl-1. DNA tersebut digunakan sebagai template dalam PCR menggunakan primer untuk gen penanda seleksi higromisin hptII. Pada kegiatan ini tidak digunakan primer spesifik untuk gen OsWRKY76, dikarenakan gen OsWRKY76 secara alami juga terdapat pada tanaman padi non-transgenik tipe liarnya, sehingga untuk membedakan antara tanaman transgenik dan non- transgenik harus digunakan primer spesifik untuk gen yang tidak terdapat di dalam tanaman non-transgenik. Gen hptII dan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 terdapat di daerah T-DNA dari plasmidvektor biner pCAMBIA- 1301. Sedangkan T-DNA adalah bagian dari plasmid vektor biner yang ditransfer oleh Agrobacterium ke dalam genom tanaman. Sehingga dalam hal ini, apabila dengan uji PCR sampel DNA menunjukkan hasil positif mengandung gen hptII yang ditandai dengan terbentuknya amplikon dengan ukuran 500 bp, maka dapat disimpulkan bahwa sampel tersebut juga mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76. Dari hasil analisis PCR menunjukkan bahwa 25 galur independen yang diuji, semua mengandung gen penanda seleksi higromisin yang diperlihatkan dengan terbentuknya amplikon berukuran sekitar 500 bp Gambar 13. Maka dapat disimpulkan bahwa 25 galur tanaman trasgenik generasi T0 yang diuji semua mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76. Dari hasil tersebut juga dapat mengindikasikan bahwa metode transformasi yang digunakan metode Greco et al. 2001 sangat efektif digunakan untuk transformasi kalus tanaman padi Nipponbare. KESIMPULAN Dari kegiatan ini telah berhasil dirakit konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 pada vektor biner pCAMBIA-1301. Introduksi rakitan vektor over- ekspresi gen OsWRKY76 melalui A. tumefaciens ke dalam tanaman padi Nipponbare menghasilkan 126 galur independen, di mana transformasi menggunakan strain Agrobacterium Agl-1 lebih banyak menghasilkan galur independen dibandingkan dengan strain EHA 105. Hasil analisis molekuler dengan teknik PCR menunjukkan bahwa dari 25 galur independen yang dianalisis, semua positif mengandung rakitan vektor over-ekspresi gen OsWRKY76. ANALISIS INTEGRASI DAN UJI EFEK OVER-EKSPRESI GEN OsWRKY76 PADA PADI NIPPONBARE TERHADAP CENDAWAN PYRICULARIA GRISEA SACC. ABSTRAK ANIVERSARI APRIANA. Analisis Integrasi dan Uji Efek Over-ekspresi Gen OsWRKY76 pada Padi Nipponbare terhadap Cendawan Pyricularia grisea Sacc. Dibimbing oleh SUDARSONO, NURUL KHUMAIDA, dan KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO. Blas merupakan salah satu penyakit yang dapat merusak tanaman padi di seluruh dunia. Over-ekspresi dari faktor transkripsi yang terlibat di dalam mekanisme pertahanan tanaman memberikan suatu pilihan untuk memperbaiki ketahanan terhadap penyakit pada tanaman. Tujuan dari penelitian ini adalah menganalisis integrasi dari konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 di dalam tanaman transgenik dan mengevaluasi ketahananan tanaman transgenik terhadap infeksi Pyricularia grisea. Analisis blot DNA memperlihatkan dari 26 galur independen yang dianalisis terdapat 1-4 kopi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 yang terintegrasi di dalam genom tanaman. Dari 6 galur independen yang mengandung kopi tunggal konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76, terdapat 3 galur independen memperlihatkan ketahanan lebih baik dari tanaman non- transgenik pada saat diinokulasi dengan Pyricularia grisea isolat 173. Kata kunci: faktor transkripsi, gen OsWRKY, ketahanan terhadap blas ABSTRACT ANIVERSARI APRIANA. Construct Integration Analysis and Blast Resistance Evaluation of Over-expression of OsWRKY76 gene in Rice. Guided by SUDARSONO, NURUL KHUMAIDA, and KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO. Blast is one of the most distructive diseases of rice worldwide. Over- expression of transcription factor involved in plant defense mechanism offers an option to improve disease resistance in plant. The aim of this research was to analyze the integration of over-expression construct of OsWRKY76 gene in the transgenic plants and to evaluate the resistance of transgenic plants to Pyricularia grisea infection. DNA blot analysis showed that a range of 1-4 copies of the over- expression construct of the OsWRKY76 gene was integrated in the genoms of randomly selected 26 independent lines. Out of 6 independent lines containing single copy of the construct, 3 independent lines showed better resistance than non-transgenic plants upon the inoculation using dominant Pyricularia grisea isolat 173. Key words : transcription factor, OsWRKY gene, blast resistance PENDAHULUAN Salah satu penyakit utama yang menyerang tanaman padi adalah penyakit blas yang disebabkan oleh cendawan Pyricularia grisea Sacc. Rossman el al. 1990. Penyakit ini dapat menyerang semua bagian dari tanaman padi. Gejala serangan dapat dilihat sebagai bercak-bercak pada daun, batang, dan leher malai yang berbentuk belah ketupat, dengan pinggir coklatcoklat kemerahan dan bagian tengah berwarna abu-abu atau putih Ou 1985; Scardaci et al. 1997. Siklus hidup penyakit diawali ketika spora cendawan blas menginfeksi dan menyebabkan bercak pada tanaman padi dan diakhiri ketika cendawan menghasilkan spora dan menyebarkan spora dengan bantuan angin. Apabila kondisi lingkungan sangat mendukung untuk pertumbuhannya, satu siklus hidup dapat terjadi dalam waktu satu minggu. Di bawah kondisi kelembaban dan suhu yang mendukung, cendawan blas dapat membentuk beberapa siklus hidup dan dapat menghasilkan spora yang sangat banyak pada akhir musim, sehingga dengan tingkat inokulum yang tinggi ini dapat merusak tanaman padi yang rentan. Kehilangan hasil karena penyakit ini dapat mencapai 50 Scardaci et al. 1997. Di dalam tanaman dikembangkan berbagai mekanisme pertahanan untuk menanggulangi penyakitpatogen. Selama infeksi oleh patogen, tanaman mengembangkan ekspresi dari sejumlah besar gen yang terlibat di dalam pertahanan. Gen-gen tersebut mengkode protein-protein yang berhubungan dengan proteksi terhadap patogen seperti glucanase dan kitinase Ryu et al. 2006. Untuk melawan serangan patogen, tanaman harus meregulasikan faktor transkripsi secara tepat dalam waktu yang tepat setelah mengenali patogen, agar dapat mengaktifasi gen-gen yang berhubungan dengan pertahanan. Mekanisme pertahanan untuk melawan penyakit dan serangan patogen tersebut dapat secara terus menerus maupun terinduksi Ryu et al. 2006. Ketahanan penyakit pada tanaman dipicu oleh adanya interaksi antara protein-protein yang dihasilkan oleh gen ketahanan di dalam tanaman gen R dan gen avirulen gen Avr dari organisme penyebab penyakit. Penelitian selama ini menunjukkan bahwa aktivasi dari protein R yang dihasilkan oleh gen R menyebabkan adanya respon ketahanan selama terjadinya infeksi oleh patogen Ayliffe et al. 2004. Beberapa penelitian tentang ketahanan pada tanaman secara molekuler menunjukkan adanya interaksi antara produk gen Avr dari patogen dan produk gen R dari tanaman. Gen Avr patogen menjadi protein elicitor yang berinteraksi secara fisik dengan protein reseptor kinase NBS-LRR yang merupakan produk gen R dari tanaman Ayliffe et al. 2004. Protein reseptor kinase yang diaktifkan melalui interaksi ini selanjutnya bisa mengaktifkan protein-protein yang lain seperti faktor transkripsi melalui mekanisme fosforilasi. Pada gilirannya faktor transkripsi ini mengaktifkan ekspresi gen-gen yang terlibat langsung dalam memberikan proteksi pada tanaman, seperti kitinase dan glucanase. Faktor transkripsi yang sudah diketahui terlibat dalam mekanisme pertahanan tanaman terhadap patogen diantaranya adalah WRKY, ERF, bZIP, dan MYB Chakravarthy et. al. 2003. Bukti-bukti yang telah ada menunjukkan bahwa perbedaan antara varietas tahan dan peka adalah pada gen R yang menyandi protein reseptor, sementara tidak ditemukan perbedaan pada mekanisme molekuler di bawahnya Vidhyasekaran 2002. WRKY merupakan suatu protein faktor transkripsi yang terlibat dalam regulasi jalur respon pertahanan tanaman. Banyak protein WRKY yang terlibat dalam pertahanan terhadap serangan patogen tanaman Ryu et al. 2006. Dengan kemampuan menempel pada bagian promoter dari gen target tersebut, protein WRKY akan mampu menekan atau meningkatkan transkripsi dari gen target Zang and Wang 2005; Ryu et al. 2006. Pada tanaman padi diperkirakan terdapat 109 gen yang termasuk dalam famili OsWRKY, tetapi banyak dari gen-gen tersebut belum diketahui fungsinya Zhang and Wang 2005; Qiu et al. 2007. Gen OsWRKY76 terletak pada segmen di kromosom 9 tanaman padi yang sebelumnya diidentifikasi terkait dengan ketahanan berspektrum luas Pada organisme eukariot pengaturan sebuah gen untuk dapat diekspresikan membentuk suatu protein harus melalui mekanisme transkripsi, pasca transkripsi, translasi, dan pasca translasi. Mekanisme pengaturan ini dilakukan oleh setiap gen endogen maupun gen spesifik yang dimasukkan ke dalam genom. Ekspresi gen meliputi proses transkripsi DNA menjadi mRNA, dan translasi mRNA menjadi protein. DNA deoxyribonucleic acid merupakan rangkaian basa nukleotida yang membawa informasi untuk membentuk protein. Empat nukleotida penyusun DNA adalah guanin G, sitosin C, adenin A dan timin T. DNA mempunyai dua rantai nukleotida rantai sense dan antisense yang berikatan satu sama lain dengan orientasi berlawanan, membentuk struktur double helix. Sedangkan mRNA messenger ribonucleic acid terdiri dari satu rantai nukleotida rantai sense, dan timin diganti dengan urasil U. Gen sendiri didefinisikan sebagai rangkaian nukleotida dari DNA yang mengkode protein Gunadi 2006. Pada proses transkripsi, informasi yang dibawa DNA diterjemahkan menjadi mRNA. Sebelum menjadi mRNA, terlebih dahulu terbentuk prekursor RNA pre-mRNA yang terdiri dari exon rangkaian nukleotida yang diterjemahkan dan intron rangkaian nukleotida yang tidak diterjemahkan. Proses pre-mRNA menjadi mRNA diawali dengan suatu proses penghilangan atau pemotongan intron yang disebut splicing Gunadi 2006. Proses selanjutnya mRNA akan ditranslasi menjadi protein. Semua fungsi dari sel tergantung dari protein. Protein mempunyai beragam fungsi yaitu mempertahankan struktur sel, mengirim pesan antar sel, sebagai pengikat dan transportasi zat-zat lain dalam darah seperti oksigen dan lipid. Protein juga berperan sebagai enzim yang mengkatalis reaksi kimia dalam organisme. Kegiatan perakitan tanaman transgenik yang melibatkan transfer DNA asing dari luar ke dalam tanaman target keberhasilannya selain tergantung pada gen yang dimasukkan ke dalam tanaman target, sistem transformasi dan regenerasi tanaman transgenik, juga sangat tergantung pada tingkat ekspresi dari gen yang dimasukkan di dalam tanaman target. Tingkat ekspresi dari DNA yang ditransfer di dalam jaringan tanaman transgenik dapat sangat bervariasi diantara galur-galur tanaman transgenik yang diperoleh. Tingkat ekspresi yang berbeda ini dapat disebabkan antara lain karena perbedaan posisi integrasi gen dalam genom tanaman yang biasa disebut sebagai “positional-effect” dan jumlah kopi gen yang terintegrasi Walden 1989. Apabila gen target masuk di daerah eukromatin di dalam kromosom tanaman, maka gen target akan dapat terekspresi dengan baik, sebaliknya apabila gen masuk target masuk di daerah heterokromatin, maka gen tidak akan terekspresi Alberts et al. 2002 BAHAN DAN METODE

1. Waktu dan Tempat penelitian