BAHAN DAN METODE
1. Waktu dan Tempat penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rumah Kaca Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
Pertanian BB- BIOGEN di Jl. Tentara Pelajar 3A, Cimanggu, Bogor 16111. Penelitian dilakukan mulai bulan Oktober 2007 sampai dengan bulan Mei 2008.
2. Bahan Penelitian 2.1. Analisis integrasi gen OsWRKY76
Bahan yang digunakan dalam kegiatan ini adalah DNA padi Nipponbare transgenik dan non-transgenik, enzim restriksi EcoRI, Agarose, Dig-11-dUTP,
blocking reagent.
2.2. Uji efek over-ekspresi gen OsWRKY76
Kegiatan uji efek over-ekspresi gen OsWRKY76 dilakukan dengan uji fenotipik bioasai tanaman padi terhadap cendawan blas bahan yang digunakan
adalah padi putatif transgenik, padi varietas Nipponbare non-transgenik, Kencana Bali sebagai cek peka. Cendawan Pyricularia grisea isolat uji 173, 033, 133,
041, dan 333 koleksi Balai Besar Penelitian Tanaman Padi BB-Padi-Muara,
Bogor digunakan untuk bahan inokulasi.
3. Metode penelitian 3.1. Analisis integrasi gen OsWRKY76
Tujuan dari kegiatan ini adalah untuk menganalisis integrasi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 di dalam tanaman transgenik. Analisis integrasi gen
OsWRKY76 dilakukan dengan menggunakan teknik hibridisasi Southern yang mengacu pada prosedur yang telah dilakukan oleh Panaud et al. 1993
menggunakan pelabelan Digoxigenin. Kegiatan tersebut terdiri dari 4 tahap, yaitu pembuatan probe dan pelabelan probe, transfer DNA yang sudah dipotong
dengan enzim restriksi dan didenaturasi pada membran Hybond N
+
Amersham,
hibridisasi membran dengan probe yang telah dilabel, dan deteksi sinyal dengan larutan NBT-BCIP Roche.
Probe higromisin dibuat dengan mengamplifikasi sebanyak 10 ul DNA plasmid pCAMBIA- 1301 konsentrasi 10 ng l dengan menggunakan primer
spesifik untuk gen higromisin hpt –II sebagai berikut Forward : 5’- GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3’ dan primer Reverse : 5’-
GCATCTCCCGCCGTGCAC- 3’. Reaksi PCR menggunakan mesin PCR PTC- 100 MJ Research, Inc.. Reaksi PCR dilakukan dalam 20 ul larutan yang
mengandung bahan-bahan sebagai berikut : 2 ul 10x buffer PCR yang mengandung MgCl
2
Roche, 0,4 ul dNTPs mix 10 mM Promega, primer spesifik untuk gen higromisin masing-masing Forward dan Reverse 1 ul 5 uM,
0,16 ul Enzim Taq-DNA polimerase 5 Uul Fast-startRoche. Profil suhu yang
digunakan adalah predenaturasi pada 94
o
C selama 4 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus denaturasi pada 94
o
C selama 30 detik, penempelan primer pada 60
o
C selama 30 detik, dan pemanjangan pada 72
o
C selama 45 detik. Pada tahap akhir PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72
o
C selama 5 menit. Sebanyak 5 ul probe higromisin kemudian dilabel dengan Digoxigenin
menggunakan teknik amplifikasi dengan PCR. Reaksi PCR dengan total volume 50 ul menggunakan primer spesifik gen higromisin Forward dan Reverse masing-
masing 1 ul 5 uM, 0,44 ul dTTP 10 mM, 0,5 ul dATP 10 mM, 0,5 ul dCTP 10 mM, dan 0,5 ul dGTP 10 mM, 0,6 ul Dig-11-dUTP 1 mM Roche, dan
0,25 ul enzim Taq-DNA polimerase 5 Uul Fast-startRoche. Profil suhu yang digunakan adalah predenaturasi pada 94
o
C selama 4 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus denaturasi pada 94
o
C selama 30 detik, penempelan primer pada 60
o
C selama 30 detik, dan pemanjangan pada 72
o
C selama 45 detik. Pada tahap akhir PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72
o
C selama 5 menit. Untuk mengetahui keberhasilan proses pelabelan probe, sebanyak 5 l produk PCR labeling
diseparasi berdampingan dengan produk amplifikasi sebelum dilabel dengan teknik elektroforesis pada gel agarose 1 wv dan hasilnya dianalisis dengan
menggunakan CEMIDOC. Produk hasil labeling akan memiliki berat molekul lebih besar dibandingkan sebelum dilabel.
Dua puluh empat DNA sampel galur independen transgenik generasi T0 dipotong menggunakan enzim restriksi EcoRI. Pemotongan dilakukan dengan
total volume 30 ul pada masing-masing DNA 24 ug, menggunakan 5 ul enzim restriksi 10 Uul.
Proses transfer DNA tanaman transgenik yang telah dipotong dengan enzim restriksi EcoRI ke membran Hybond -N
+
diawali dengan pemisahan separasi DNA menggunakan 1 gel agarose dalam 0,5x buffer TBE Tris-Boric
acid-EDTA selama + 16 jam semalam pada tegangan 20 volt. DNA yang telah terseparasi kemudian direndam dalam larutan depurinasi 0,25 M HCl selama 7
menit, kemudian dibilas dengan aquades, diikuti dengan perendaman dalam larutan denaturasi 0,5 N NaOH + 1,5 M NaCl selama 2 x 15 menit, dan terakhir
direndam dalam larutan netralisasi 1 M Tris-HCl pH 7,5 + 1,5 M NaCl selama 30 menit. Semua proses dilakukan dengan menggoyang gel agarose di dalam
larutan tersebut. Transfer DNA ke membran Hybond -N
+
dilakukan dengan proses kapiler menggunakan 10x buffer SSC selama + 16 jam semalam. Setelah DNA
berpindah ke membran, DNA pada membran difiksasi menggunakan UV Stratalinker Stratagen pada 120 mjoule.
Membran yang mengandung DNA kemudian dihibridisasi dengan probe yang sudah terlabel. Proses ini dimulai dengan memanaskan larutan prehibridisasi
pada suhu 65
o
C. Membran direndam dalam 50 mL larutan prehibridisasi 5x SSC, 0,1 SDS,1 blocking reagent Roce pada kotak plastik pada suhu 65
o
C selama 3 jam sambil digoyang pelan. Larutan prehibridisasi kemudian diganti dengan 30
mL larutan hibridisasi 5x SSC, 0,1 SDS,1 blocking reagent Roche yang mengandung 250 ul probe yang telah dilabel dan sudah didenaturasi direbus di
dalam air mendidih selama + 10 menit dan langsung ditambahkan pada larutan hibridisasi, kemudian diinkubasi semalam dalam environ shaker pada suhu 65
o
C. Membran yang sudah dihibridisasi kemudian dicuci dengan larutan Wash
1 2x SCC + 0,1 SDS pada suhu kamar selama 2 x 5 menit, diikuti dengan pencucian dengan larutan Wash 2 0,5x SSC + 0,1 SDS pada suhu 65
o
C selama 2 x 15 menit. Membran diseimbangkan dengan larutan Buffer 1 0,1 M
Tris-HCl pH 7,5 + 0,15 M NaCl selama 2 menit, diikuti dengan inkubasi membran dalam larutan Buffer 2 1 blocking reagent Roce dalam Buffer 1
selama 30 menit. Membran diinkubasi selama 30 menit dalam 20 mL larutan AP antibody conjugate Anti-dig Roche yang diencerkan 5000x dalam Buffer2.
Untuk menghilangkan kelebihan antibody conjugate, membran diinkubasi selama 2 x15 menit dalam Buffer 1 + SDS, diikuti dengan 2 x 15 menit dalam Buffer1.
Membran diseimbangkan dalam Buffer 3 selama 5 menit. Untuk pendeteksian sinyal dilakukan perendaman membran dalam larutan NBT-BCIP Roche. Enzim
Alkaline Phosphatase AP pada molekul konjugat akan mengkatalisa perubahan substrat NBT-BCIP menjadi senyawa baru yang berwarna biru. Membran
diinkubasi dalam ruang gelap, dan hasilnya dapat dilihat setelah + 30 menit.
3.2. Uji efek over-ekspresi gen OsWRKY76
Kategori