3.2. Transformasi padi Nipponbare dengan Agrobacterium
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengintroduksikan rakitan konstruk vektor over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam genom tanaman padi
varietas Nipponbare menggunakan bantuan Agrobacterium tumefaciens. Metode transformasi yang digunakan mengikuti prosedur yang diuraikan dalam Greco et
al. 2001 dengan sedikit modifikasi.
Benih padi varietas Nipponbare Japonica dikupas sekamnya dan
disterilisasi dengan larutan alkohol 70 selama 1 menit. Kemudian biji direndam menggunakan larutan NaOCl komersial dengan konsentrasi 5,25 selama 30
menit, dicuci dengan akuades steril sebanyak 6 kali masing-masing selama 15 menit, dan direndam semalam dalam aquades steril pada suhu ruang. Biji padi
kemudian ditanam pada media induksi kalus yaitu media dasar NB Lampiran 1 yang mengandung 30 gL sukrosa , 2,5 mgL hormon 2,4-D, dan dipadatkan
dengan 2,5 gL Phytagel . Setelah 25-30 hari kalus yang tumbuh disubkultur pada media induksi kalus baru. Dua minggu kemudian kalus yang tumbuh diseleksi
dengan menggunakan mikroskop binokuler untuk mendapatkan kalus yang embriogenik. Kalus embriogenik ini digunakan sebagai bahan untuk transformasi
dengan menggunakan Agrobacterium yang telah mengandung plasmid rekombinan yang membawa konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76.
Transformasi dilakukan dengan merendam kalus-kalus embriogenik ke dalam suspensi bakteri Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105
yang mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76. Biakan bakteri yang digunakan untuk transformasi berasal dari biakan koloni tunggal yang
ditumbuhkan pada 5 mL media YEP Lampiran 2 cair yang mengandung 100 mgL antibiotik kanamisin dan 75 mgL karbenisilin. Suspensi bakteri yang
tumbuh kemudian ditumbuhkan pada 3-4 petri media AB Lampiran 2 padat yang mengandung 100 mgL antibiotik kanamisin dan 75 mgL karbenisilin selama 3
hari pada suhu 28
o
C. Biakan bakteri tersebut disuspensikan pada 50 mL media ko- kultivasi cair yaitu media dasar R2 Lampiran 1 yang mengandung 10 gL
glukosa, 100 uM asetosiringon dan 2,5 mgL hormon 2,4-D dengan pH 5,2. Kepadatan sel bakteri yang digunakan untuk transformasi diperkirakan mencapai
OD600=1 3-5x10
9
selmL. Suspensi bakteri inilah yang digunakan untuk
merendam kalus. Perendaman kalus-kalus dilakukan selama 10-15 menit. Kalus- kalus kemudian dikeringkan dengan mengguling-gulingkannya di atas kertas
saring dan ditanam pada media ko-kultivasi padat selama 3 hari dengan kondisi pemeliharaan dalam keadaan gelap pada suhu 16-18
o
C. Kemudian kalus-kalus dipindahkan pada media seleksi yaitu media R2 yang mengandung 2,5 mgL 2,4-
D, 400 mgL antibiotik cefotaksim, 100 mgL vancomisin, 50 mgL higromisin, dan 30 gL sukrosa. Dua minggu kemudian kalus-kalus dipindahkan ke media
seleksi yang baru. Kalus-kalus yang tahan di media seleksi kemudian disubkultur ke media EIM media induksi embrio Lampiran 1 yang mengandung 100 mLL
air kelapa, 2,5 mgL 2,4-D, dan 100 mgL antibiotik cefotaksim, 100 mgL vancomisin, dan 50 mgL higromisin dan dipelihara dalam keadaan gelap. Setelah
10-14 hari kalus- kalus embriogenik diseleksi dengan menggunakan mikroskop binokuler dan dipindahkan ke media regenerasi yaitu media dasar LS yang
mengandung sukrosa 40 gL, 0,5 mgL IAA + 0,3 mgL BAP, 30 mgL higromisin, 100 mgL cefotaksim, 100 mgL vancomisin. Dua minggu kemudian
kalus disubkultur ke media regenerasi yang baru. Kalus-kalus dipelihara sampai tumbuh tunas. Setelah ukuran tunas kurang lebih 2 cm dipindahkan ke media
perakaran yang mengandung 40 mgL antibiotik higromisin. Apabila akar planlet sudah berkembang, planlet dikeluarkan dari botol dan diaklimatisasi di dalam
tabung reaksi yang berisi air. Seminggu kemudian planlet dipindahkan ke bak persemaian yang berisi tanah lumpur. Dua minggu kemudian planlet dipindah ke
dalam ember yang berisi tanah lumpur yang telah ditambah pupuk kandang di rumah kaca.Tanaman putatif transgenik dipelihara sampai menghasilkan biji.
Parameter yang diamati adalah jumlah kalus awal yang ditransformasi, jumlah kalus yang terseleksi pada media seleksi, jumlah kalus yang berhasil beregenerasi
membentuk planlet, jumlah tanaman, jumlah galur independen yang berhasil diperoleh.
3.3. Analisis molekuler tanaman transgenik dengan teknik PCR