71
4.3 Metode Angka Lempeng Total.
Di kalangan industri pangan, pengujian E.coli dan total Koliform selain menggunakan metode APM juga banyak menggunakan metode ALT Cawan
tuang dan membran filtrasi. Berdasarkan pengalaman penulis selama menjadi Product Manager untuk Mikrobiologi di Merck , di Indonesia, metode APM lebih
banyak digunakan oleh kalangan institusi pemerintahan atau beberapa industri lokal yang mengacu kepada SNI. Di sebagian besar industri pangan skala
menengah ke atas umumnya lebih memilih menggunakan metode angka lempeng total dengan cara cawan tuang pour plate, karena metode APM dianggap lama
dan merepotkan. Adapun media yang paling banyak digunakan di industri pangan di
Indonesia untuk uji Koliform adalah Violet Red Bile Agar VRBA. Media ini juga direkomendasikan oleh ISO, APHA, BAM, IDF-FIL, SMDP Merck, 2005.
Karena banyaknya pertanyaan dari kalangan industri pangan ke penulis tentang perbandingan antara hasil APM dan ALT untuk uji Koliform dan E.coli, maka
dalam penelitian ini juga dilakukan perbandingan keduanya. Medium VRBA adalah medium yang diusulkan oleh Davis pada tahun 1951 untuk deteksi dan
perhitungan bakteri Koliform termasuk E.coli di air, susu, ice-cream, daging dan bahan pangan lainnya Merck, 2005. Medium ini sesuai dengan rekomendasi dari
American Public Health Association 1992, the International Dairy Federation FIL-IDF Internationaler Milchwirtschaftsverband 1985, the Institute for Food
Technology and Packaging Institut für Leben-mitteltechnologie und Verpackung 1974.
Gambar 15 Pertumbuhan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media VRBA
72 Apabila dilihat dari komposisi media VRBA Tabel 8 maka pertumbuhan
bakteri secara umum didukung oleh adanya peptone from meat, NaCl dan Yeast extract. Sebagai sumber karbohidrat yang utama adalah laktosa yang sekaligus
juga menjadi pembeda antara Enterobacteriaceae yang laktosa positif dan negatif. Degradasi laktosa menjadi asam oleh bakteri laktosa positif membuat indikator
pH neutral red memberi warna merah pada koloni bakteri tersebut dan menyebabkan presipitasi bile acids membentuk halo kemerahan disekitar koloni.
Penghambatan terhadap bakteri gram positif dimungkinkan oleh adanya crystal violet dan bile salts yang kadang justru juga menghambat pertumbuhan bakteri
Koliform dan E.coli apabila dalam keadaan sublethal injured sakit ISO, 2004; Merck, 2004 2005.
Tabel 8. Perbandingan antara komposisi media VRBA, CCA dan TBX Agar
Komposisi Media g l Deskripsi
VRBA CCA
TBX Agar Peptone
7.00 meat
3.00 20.00
Yeast Extract 3.00
Sodium chloride 5.00
5.00 Lactose
10.00 Neutral Red
0.03 Bile salt
1.50 mixture
1.50 No.3
Crystal violet 0.002
Sodium dihydrogen phospat 2.20
di-sodium hydrogen phospat 2.70
Sodium pyruvat 1.00
Tryptophane 1.00
Sorbitol 1.00
Tergitol 7 0.15
Chromogenic mixture 0.40
0.075 Agar-agar
13.00 10.00
15.00 Total penggunaan media gl
39.53 26.50
36.60 Harga per botol 500g
Rp. 920.000 Rp. 4.490.000
Rp. 7.555.000 Harga per petri 15 ml
Rp. 1.091 Rp. 3.563
Rp. 8.290 Pembacaan hasil
Koliform saja Koliform, E. coli
E. coli saja CCA : Chromocult Coliform Agar
TBX Agar : Chromocult TBX Agar Harga media berdasarkan pada Price List 2009 yang dikeluarkan PT Merck Tbk
Selain itu, media VRBA tidak bisa secara spesifik membedakan antara E.coli, Koliform dengan Enterobacteriaceae lainnya, tetapi hanya membedakan
bakteri yang bersifat laktosa positif dan laktosa negatif saja yang semuanya
73 memunculkan warna merah dikelilingi zone presipistasi Gambar 15. Beberapa
strain Klebsiella yang juga merupakan anggota koliform dan Enterococci tumbuh sebagai koloni pink dengan ukuran sangat kecil pin-point sehingga
memungkinkan terjadinya kesalahan pembacaan hasil Merck, 2005. Kesulitan lain penggunaan media ini apabila mengikuti prosedur ISO 4832:2004 adalah
pemanasan media dalam air mendidih tidak boleh lebih dari 2 menit dan media harus digunakan dalam waktu tiga jam setelah dibuat ISO, 2004.
Di lain pihak, ada kebutuhan industri pangan akan media baru yang dapat memberikan hasil yang lebih cepat dan akurat dengan pengerjaan yang mudah.
Seperti pada metode APM sebelumnya, penggunaan substrat kromogenik untuk pengujian Koliform dan E.coli juga sudah banyak digunakan dalam media agar,
misal media TBX agar untuk ISO 16649:2001 dan Chromocult
®
Coliform Agar USEPA, 2007. Pada media TBX, kromogen yang digunakan hanya satu macam
dan hanya untuk mendeteksi sifat ß–glucuronidase yang ada di E. coli saja dengan warna koloni hijau ISO, 2001. Media TBX di Indonesia tidak populer karena
peraturan pemerintah maupun perusahaan yang ada di Indonesia pada umumnya menghendaki uji Koliform dan E.coli sekaligus. Media Chromocult
®
Coliform Agar CCA lebih sesuai dan lebih diterima untuk keperluan Indonesia karena bisa
mendeteksi keduanya yaitu Koliform berwarna merah salmon sedang E.coli biru tua sampai violet.
Pada penelitian ini hanya dilakukan perhitungan Angka Lempeng Total dengan Media CCA saja, tanpa membandingkan dengan VRBA dan TBX karena
tujuannya adalah untuk membandingkan metode ALT yang lebih sederhana cara pengerjaannya dengan metode perhitungan APM konvensional. Dari hasil
perhitungan sampel terlihat bahwa semua sampel yang positif metode APM, baik yang konvensional maupun yang cepat, juga memberikan hasil positif di CCA.
Sampel air proses yang tidak dicemari juga memberikan hasil negatif, sama dengan kedua metode APM Tabel 9. Data tersebut disajikan dalam nilai cfu100
ml sesuai dengan perhitungan APM yang juga per 100 ml. Dari data Anova untuk perhitungan antara cemaran saja dan sampel + cemaran dalam konsentrasi
rendah Lampiran 11 diperoleh nilai F hitung lebih besar dari F tabel dan nilai P lebih besar dari 5 yang menunjukkan hasil yang tidak beda nyata.
74 Tabel 9. Hasil pengujian dengan media Chromocult
®
Coliform Agar
Kontrol Positif cfu100 ml Sampel ber E. coli cfu100 ml
Ulangan Sampel
air proses Rendah Sedang Tinggi
Rendah Sedang Tinggi
1 188
1963 4000
200 2275
4163 2
175 1188
2875 238
1613 3188
3 150
2000 4350
175 1838
3600 Rerata
171 1717
3742 204
1908 3650
Catatan : Rendah : konsentrasi bakteri E.coli dalam sampel 4 cfuml
Sedang : konsentrasi bakteri E.coli dalam sampel 40 cfuml Tinggi : konsentrasi bakteri E.coli dalam sampel 80 cfuml
Pada Tabel 10 tampak sifat pertumbuhan beberapa bakteri pada media CCA, didasarkan pada sifat pemecahan substrat salmon-GAL, X-glucuronide dan asam
amino tryptophan untuk test indol. Pemecahan substrat Salmon-GAL oleh enzim ß-D-galactosidase yang dimiliki oleh total Koliform termasuk E.coli ditandai
dengan munculnya warna merah salmon pada koloni. Pemecahan substrat X- Glucuronide oleh enzim ß-D-glucuronidase yang dimiliki oleh E.coli dan
beberapa bakteri lainnya ditandai dengan warna biru terang sampai torquoise. Khusus untuk E.coli yang memiliki kedua enzim tersebut akan memecah kedua
substrat tersebut menghasilkan gabungan antara warna merah salmon dan torquoise menjadi warna biru gelap sampai violet Gambar 16. Gram negatif lain
yang tidak memiliki kedua macam enzim tersebut tumbuh sebagai koloni tak berwarna Merck, 2005; Manafi, 1995; Manafi dan Rosmann, 1998b.
Tabel 10 Karakteristik beberapa bakteri di media Chromocult
®
Coliform Agar
Test strains Recovery
rate Pertumbuhan
Warna koloni
Salmon- GAL
X – Glucu
ronide Indole
Escherichia coli ATCC 11775
≥ 70 Bagus sangat
bagus biru gelap
- violet +
+ +
Citrobacter freundii ATCC 8090
70 Bagus sangat
bagus merah
salmon +
- -
Escherichia coli DSMZ 502
70 Bagus sangat
bagus biru-violet
+ -
+ Salmonella enteritidis
ATCC 13076 Tidak
terbatas Bagus sangat
bagus tak
berwarna -
- -
Enterococcus faecalis ATCC 19433
0.01 tidak tumbuh
Sumber : Microbiology Manual Merck 2005
75 Warna yang timbul pada koloni oleh kromogen tersebut akan tetap stabil
untuk beberapa hari, tidak terpengaruh oleh nilai pH, temperatur, atau cahaya. Karena pewarnaan tersebut tidak terdifusi ke agar maka pembedaan masing-
masing koloni dimungkinkan dalam media ini, bahkan apabila terjadi pada perhitungan koloni yang tinggi Merck, 2005
Hasil false negatif pada media kromogenik dimungkinkan terjadi pada strain Escherichia coli yang bersifat ß-glucuronidase negatif, seperti Escherichia coli
O157 ISO, 2001. Dalam Manafi et.al 1991 disebutkan bahwa ada korelasi kuat antara E.coli pembentuk verotoksin dengan sifat ß-glucuronidase negatif
sehingga memberikan hasil negatif pada media kromogenik tidak membentuk koloni hijau dan fluorogenik fluoresensi negatif walaupun dapat tumbuh.
Dalam hal aktifitas ß-D-galactosidase X-Gal, hanya beberapa strain Vibrio metschnikovii, V. vulnificus, Aeromonas hydrophila dan A.sobria memberikan
reaksi “false positive” X-Gal Manafi, 1995; Geissler et al., 2000. Ley et al 1993 menemukan bahwa semua strain Aeromonas, Citrobacter dan Enterobacter
yang diisolasi dari air baku raw water dalam medium yang mengandung X-Gal bersifat ß-D-galactosidase positif. Sebaliknya, hanya 10-20 saja dari strain-
strain tersebut yang menghasilkan warna merah dengan kilap logam pada media m-Endo agar LES.
Gambar 16. Pertumbuhan Citrobacter freundii ATCC 8090 dan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media Chromocult
®
Coliform Agar sumber : Merck 2005
76 Dari total 674 sampel air berklorinasi yang ditanam di m-Endo agar LES
dan medium yang mengandung X-Gal, 18 yang negatif di Endo memperlihatkan hasil positif di Medium X-Gal. Dari 50 bakteri yang bersifat ß-D-galactosidase
positif, 76 diidentifikasi sebagai Aeromonas hydrophila Ley et al, 1993. Ossmer 1993 juga menyebutkan bahwa X-Gal memberikan hasil yang lebih
cepat dan lebih sensitif untuk Koliform total daripada produksi gas dari laktosa. Untuk keperluan konfirmasi koloni E.coli, cukup dengan memberikan satu
tetes KOVACS indole reagent kepada koloni yang berwarna biru gelap sampai violet. Apabila pereaksi tersebut berubah menjadi warna merah cherry Gambar
17 setelah beberapa detik maka dapat dikonfirmasikan bahwa terjadi pembentukan indol yang memberi kepastian 99 bahwa koloni tersebut
memang E.coli. Kemungkinan untuk melakukan test indol langsung di agar yang sama membuat CCA menjadi unik dan sangat membantu memepercepat uji E.coli
Merck, 2005; Manafi, 1995; Manafi dan Rosmann, 1998b. Media CCA terbukti dalam beberapa penelitian, memang memiliki tingkat
akurasi yang tinggi yaitu 94-96 untuk sifat enzimatis GUD positif; 99 untuk sifat indol positif Manafi, 1991; dan 98 untuk sifat GAL positif Geissler et al,
2000. Selain itu ada 3-4 strain E.coli yang mempunyai sifat ß-D-glucuronidase negatif, yang akan membentuk koloni tak berwarna misal E.coli O157 atau juga
strain yang tidak dapat tumbuh pada temperatur 44 °C misal E. coli 0157:H7 Merck, 2005. Pendekatan pengujian cepat dengan media kromogenik misal
identifikasi Escherichia coli menggunakan one-day cultivation bahkan juga sudah diakui pentingnya oleh WHO sebagai metode alternatif, selain penggunaan probe
fluoresense secara mikroskopis dan teknik laser scanning WHO, 2002. Geissler et.al 2000 membandingkan kinerja dari Fluorocult
®
LMX Broth, Chromocult
®
Coliform Agar CCA dan Chromocult
®
Coliform Agar ditambah cefsulodin 10 gml CCA-CFS dengan metode standar APM untuk perhitungan
Koliform dan E.coli di air pantai untuk rekreasi. Dalam penelitian Geissler ini juga dibuktikan bahwa standar APM konvensional memberikan hasil yang kurang
sensitif untuk perhitungan E.coli., walaupun secara statistik tidak ada beda nyata antara LMX, CCA, CCA-CFS dan APM untuk perhitungan E.coli.
77 Gambar 17. Pembentukan warna cherry red pada koloni Escherichia coli
setelah ditetesi reagen KOVAC’s.
Di lain pihak penggunaan media CCA-CFS untuk angka lempeng total memberikan hasil yang lebih akurat untuk total Koliform karena gangguan
background flora lebih terkurangi. Karena itu kontribusi bakteri ß-galactosidase positif, non Koliform terutama Aeromonas spp. dan Vibrio spp. dalam
perhitungan angka lempeng total tidak bisa diabaikan begitu saja. Penggunaan larutan PDF sebagai pengencer tanpa penambahan NaCl juga
berpotensi menyebabkan kerusakan sel karena bukan larutan yang bersifat isotonis. Selain itu, tidak adanya kandungan peptone dalam cairan pengencer menyebabkan
tidak ada efek recovery sehingga sel bakteri yang sublethal injured kemungkinan akan sulit tumbuh. ISO 6887 menganjurkan digunakannya larutan pengencer
Maximum Recovery Diluent yang per liternya mengandung 85 g NaCl dan 1 g peptone yang mempunyai efek recovery dari peptone dan isotonik dari NaCl
fisiologis sehingga tidak terjadi kerusakan sel pada sampel Merck, 2005. Pengaruh tersebut juga diduga menjadi sebab dari rendahnya recovery rate media
CCA di penelitian ini Tabel 11 yang seharusnya 70 Merck, 2005.
78 Tabel 11 Recovery rate Escherichia coli di media Chromocult
®
Coliform Agar dibandingkan dengan konsentrasi awal bakteri sampel
Kontrol positif Sampel ber E. coli
Ulangan Rendah
Sedang Tinggi
Rendah Sedang
Tinggi 1
47 49
50 50
57 52
2 44
30 36
59 40
40 3
38 50
54 44
46 45
Rerata 43
43 47
51 48
46 Catatan :
Rendah konsentrasi cemaran 4 cfuml, Sedang 40 cfuml dan Tinggi 80 cfuml
Dari komunikasi pribadi dengan Rolf Ossmer 18 Maret 2009 yang mengembangkan Chromocult
®
Coliform Agar di Laboratorium RD Merck KGaA di Jerman, seharusnya recovery rate dari media CCA untuk E.coli adalah
70 70-100. Rendahnya recovery rate dalam penelitian ini kemungkinan karena sampel tidak terdistribusi dengan baik di cawan petri, yang disebabkan
oleh teknik pencampuran sampel dengan media pada metode cawan tuang yang salah. Area berwarna violet di agar Gambar 18 merupakan indikasi tempat
terkumpulnya bakteri, sehingga jumlah koloni yang terpisah secara sempurna menjadi berkurang.
Pada metode cawan tuang, koloni yang tumbuh di dekat permukaan agar- agar dapat tumbuh dalam dua koloni dengan morfologi yang berbeda, yaitu koloni
kecil didalam agar dan koloni yang lebih besar di permukaan agar. Pertumbuhan koloni dipermukaan agar-agar seringkali sangat kuat dengan warna dan ukuran
yang atypical. Penyebab dari terbentuknya koloni atypical seperti pada Gambar 18 belum diketahui tetapi mungkin telah terjadi penghambatan pada reaksi
enzimatis oleh kombinasi beberapa komponen dari material sampel dengan pertumbuhan yang terjadi di permukaan. Hal ini bisa diatasi dengan melakukan
overlayer pada CCA seperti yang banyak direkomendasikan oleh banyak prosedur standar. Pada medium CCA, apabila muncul koloni atypical, maka semua koloni
dengan warna violet di tengah koloni atau warna violet yang terdifusi kedalam agar adalah koloni E.coli Ossmer R 27 Maret 2009, komunikasi pribadi
79 Gambar 18 Pertumbuhan koloni Escherichia coli atypical di media Chromocult
Coliform Agar. Dalam penelitian ini memang tidak dibandingkan antara metode ALT
menggunakan media VRBA dan CCA karena tujuan utama adalah membanding- kan antara APM dengan ALT yang dalam hal ini diwakili oleh CCA
. Pemilihan
CCA sendiri seperti diterangkan diatas adalah karena beberapa keunggulan yang dimiliki CCA seperti ketelitian, kepraktisan dan kecepatan hasil. Penelitian yang
membandingkan VRBA dan CCA telah dilakukan oleh Gonzales et.al pada tahun 2003 pada sampel makanan siap saji ready-to-eat foods. Dari hasil penelitian
tersebut disimpulkan bahwa CCA memiliki beberapa keuntungan dibandingkan dengan VRBA yaitu hanya memerlukan satu medium untuk mendeteksi Koliform
dan E.coli, mengurangi biaya, mengurangi waktu secara nyata, dan mengurangi kecenderungan terjadinya kontaminasi silang dibanding metode-metode lainnya.
4.4 Metode Presence Absence.
Kategori