51 media Fluorocult
®
LMX Broth. Pereaksi yang digunakan adalah pereaksi KOVAC’S indole reagent untuk test indole. Pengamatan fluoresensi
menggunakan lampu UV dengan panjang gelombang 366 nm. Untuk metode ALT cepat yang merupakan kelompok ketiga digunakan
media Chromocult
®
Coliform Agar CCA, dan pereaksi KOVACS indole reagent untuk mengkonfirmasi pembentukan indol oleh koloni E.coli. Kelompok
keempat adalah metode Presence Absence cepat menggunakan media Readycult
®
Coliforms 100, pereaksi KOVACS indole reagent dan lampu UV 366 nm untuk pengujian fluoresensi. Semua media dan pereaksi menggunakan produk Merck
KGaA-Germany. Peralatan yang digunakan adalah inkubator 35-37
o
C, tangas air, otoklaf, kabinet keamanan biologis kelas II, laminar air flow, lemari pendingin, neraca,
lampu UV 366 nm, cawan petri, tabung reaksi, gelas beaker, botol laboratori, erlenmeyer, tabung durham, pipet ukur, pipet tetes, jarum inokulasi, jarum ose,
dan lampu bunsen.
3.3 Metode Penelitian
Dalam penelitian ini dilakukan beberapa tahapan kerja yaitu: 1 persiapan inokulum, 2 persiapan sampel yang di-inokulasi dengan E.coli ATCC 25922, 3
Inkubasi dan pembacaan hasil pertumbuhan, 4 perhitungan hasil. melakukan analisa pertumbuhan, menghitung recovery rate, menghitung waktu analisa, dan
menghitung biaya yang digunakan.
3.3.1 Persiapan inokulum bakteri dan sampel
Kultur bakteri yang akan dipergunakan diambil dari cryobank dan diremajakan menggunakan media Brain Heart Infusion Broth BHIB sebelum
digunakan. Untuk perhitungan jumlah sel dalam stok suspensi, satu ml suspensi kultur dari BHIB yang sudah berumur 24 jam dibuat seri pengenceran sampai 10
-9
menggunakan Peptone Dilution Fluid PDF. Dari masing-masing pengenceran diambil satu ml dan ditanam di cawan petri yang berisi Plate Count Agar PCA
yang telah ditambahkan TTC Triphenyl Tetrazolium Cloride 1, dengan metode cawan tuang. Penambahan TTC dilakukan untuk memudahkan
52 perhitungan koloni karena warna koloni menjadi merah. Sambil menunggu hasil
perhitungan, stok suspensi bakteri tersebut disimpan dalam lemari pendingin. Stok suspensi ini selanjutnya akan digunakan untuk melakukan cemaran ke
sample air proses maupun pembuatan kontrol positif dengan larutan PDF. Sampel air proses diambil dari PT Yummy Food Utama pada pagi hari
dengan menggunakan botol laboratori steril ukuran 1000 ml. Sampel air disiapkan sebanyak 8 botol untuk 4 macam perlakuan dengan masing-masing dua ulangan.
Semua sampel dibawa dalam cool box dengan ice pack untuk menjaga agar tetap dingin selama perjalanan ke Laboratorium PPOMN. Pengambilan sampel dan
pengujian dilakukan dalam tiga periode yaitu tanggal 18 Mei sampel 1, 3 Juni sampel 2, dan 26 Juni 2008 sampel 3 sesuai dengan tanggal pengujian.
Dari 8 botol sampel air proses tersebut 6 botol sampel digunakan untuk perlakuan sampel + cemaran dengan 3 konsentrasi cemaran, masing-masing dua
ulangan yaitu S1C dan S2C. Dua botol sampel air proses lainnya digunakan untuk perlakuan sampel tanpa cemaran dua ulangan S1 dan S2. Sebagai kontrol
positif yaitu perlakuan cemaran digunakan larutan PDF steril sebanyak 1 liter dengan dua ulangan yaitu C1 dan C2. Masing-masing ulangan dibuat duplo.
Sampel air proses dan larutan PDF steril yang akan dicemari tersebut dituang secara aseptis di dalam Laminar Air Flow kedalam tabung erlenmeyer steril
ukuran dua liter dan diinokulasi dengan suspensi bakteri standar yang sudah disiapkan.
Dalam penelitian ini digunakan tiga konsentrasi bakteri E. coli pada setiap sampel sedemikian rupa sehingga konsentrasi akhir pada sampel yang akan
diinokulasikan ke media adalah konsentrasi rendah 10 cfuml, konsentrasi sedang 10-50 cfuml, dan konsentrasi tinggi 50-100 cfuml. Untuk membuat
sampel ber E.coli rendah 10 cfuml diambil satu ml dari pengenceran 10
-6
dengan konsentrasi bakteri sebesar 4.10
3
kemudian diinokulasikan ke 1000 ml larutan PDF steril dan 1000 ml sampel air proses, sehingga diperoleh sampel ber
E.coli 4 cfuml. Dengan cara yang sama dibuat sampel ber E.coli 10-50 cfuml dari satu ml dari pengenceran 10
-5
dengan konsentrasi sebesar 4.10
4
cfuml sehingga diperoleh konsentrasi sel pada sampel sebesar 40 cfuml. Untuk
membuat sampel ber E.coli 50-100 cfuml diambil dua ml dari pengenceran 10
-5
53 sehingga diperoleh konsentrasi sel pada sampel sebesar 80 selml. Setelah di
gojog sampai homogen, semua jenis sampel diatas tersebut diambil masing- masing 10 ml dan dimasukkan ke tabung steril 20 ml yang sudah disiapkan. Dari
perhitungan yang dilakukan saat pembuatan inokulum maka konsentrasi akhir dari sample adalah 4 cfuml rendah, 40 cfuml sedang, dan 80 cfuml tinggi.
3.3.2 Inokulasi sampel
