35 2004. Koliform berasal dari lingkungan sedangkan koliform fekal dan E. coli
berasal dari kotoran fekal hewan maupun manusia USEPA, 2001. Standar untuk air minum menurut KEPMENKES 907, Council Directive
9883EC maupun WHO adalah kandungan bakteri koliform maupun E. coli harus negatif dalam 100 ml sampel air minum Depkes, 2002; EC, 1998; dan WHO,
2004. USEPA 2001 mensyaratkan bahwa dalam satu bulan jumlah sampel yang positif koliform tidak boleh lebih dari 5 dari total sampel dan untuk system
yang jumlah sampelnya kurang dari 40 per bulan maka tidak boleh lebih dari satu sampel yang positif koliform. Semua sampel yang positif koliform harus
dianalisa E. coli atau koliform fekal cukup salah satu untuk menentukan apakah ada pencemaran dari fekal manusia atau hewan.
2.4 Metode Pengujian Bakteri Koliform dan E.coli
Salah satu alasan mengapa koliform total dan E.coli paling banyak digunakan sebagai bakteri indikator adalah karena cara pengujiannya yang relatif
mudah dan cepat. Pengujian mikrobiologis mungkin memberikan akurasi hasil yang bervariasi karena pemilihan medium pertumbuhan dan temperatur inkubasi.
Disamping itu, kondisi asal dan umur sampel air dapat mempengaruhi spesies yang terisolasi serta jumlahnya WHO, 2006. Media yang digunakan untuk
pengujian koliform dan E. coli bisa media konvensional yang berbasis fermentasi karbohidrat atau media cepat yang berbasis fluorogenik danatau kromogenik.
Media konvensional pada umumnya berdasarkan pada kemampuan bakteri koliform dalam memfermentasi laktosa oleh enzim ß-D-galactosidase,
menghasilkan asam dan gas. Asam yang terbentuk akan mengubah indikator yang ada dalam media tersebut menjadi warna tertentu, baik pada media maupun pada
koloni bakteri. Gas yang terjadi karena fermentasi laktosa akan ditangkap dengan tabung durham pada medium cair atau akan menimbulkan rekahan di media padat.
Beberapa reaksi lain yang mungkin timbul sesuai komposisi medianya adalah terbentuknya kilap logam Endo Agar dan EMB agar atau terjadinya presipitat
disekitar koloni pada Violet Red Bile Agar Manafi, 1996; Merck, 2005. Beberapa media konvensional yang umum digunakan yaitu Lactose Broth
LB, Brilliant Green Bile 2 Broth BGLB, Lauryl Sulfate Tryptose
36 BrothLauryl Tryptose Broth LST, MacConkey Broth MCB, MacConkey Agar
MCA, EC BrothMedium, Violet Red Bile Agar VRBA, Endo Agar, Eosin Methylen Blue Agar EMBA, Levine EMB Agar LEMBA, m-Endo Agar LES,
A 1 Medium, dan P-A Broth APHA, 2005; ISO, 2004; Merck, 2005; USEPA, 2007.
Secara umum, penggunaan media konvensional untuk pengujian bakteri indikator masih belum bisa membedakan antara bakteri laktose positif, bakteri
kelompok koliform dan bakteri E. coli. Untuk membedakannya diperlukan tahapan identifikasi atau konfirmasi dari koloni terduga yang tumbuh di media
agar untuk isolasi. Porses identifikasi tersebut selain memerlukan waktu yang banyak, juga memerlukan beberapa tahapan pengerjaan Manafi, 1996.
Kebutuhan untuk mendapatkan hasil pengujian mikrobiologis secepatnya, terutama untuk produk pangan yang masa pakainya singkat, mendorong berbagai
penelitian tentang media yang lebih cepat, praktis dan akurat. Beberapa media baru yang sesuai dengan kebutuhan tersebut sudah mulai diterima dan diakui oleh
beberapa Lembaga Internasional seperti APHA, WHO, USEPA, ISO, dan FDA. Umumnya media yang digunakan adalah yang menggunakan enzim spesifik
sebagai target penanda suatu mikroorganisme tertentu APHA, 2005; ISO, 2001; USEPA, 2007, WHO, 2002.
Suatu mikroorganisme bisa mempunyai satu atau lebih enzim yang spesifik dan esklusif, yang dapat menggunakan substrat tertentu yang sesuai
misalnya substrat-enzim fluorogenik dan khromogenik. Substrat tersebut dicampurkan kedalam media cair atau padat yang dipergunakan untuk
menumbuhkan organisme tersebut. Penemuan substrat tersebut telah memicu pengembangan sejumlah besar metode untuk identifikasi mikroorganisme, bahkan
untuk media isolasi awal. Penambahan substrat-enzim ini ke medium selektif dapat menghilangkan kebutuhan untuk subkultur dan test biokimia lanjutan untuk
meyakinkan identitas suatu mikroorganisme tertentu Manafi, 1996; Manafi, 2000.
37
Enzim
Methyl-umbelliferon Karbohidrat
Enzim
Tak Berwarna
Fluoresens
i
Sinar UV 366 nm
Enzim ß-D-Glucurondase
Media Fluorogenik
Media substrat-enzim fluorogenik umumnya mengandung substrat yang spesifik terhadap enzim tertentu seperti gula atau asam amino dan fluorogen
seperti 4-methylumbelliferone, yang interaksinya dapat mengubah sinar UV menjadi sinar yang tampak. Sebagian besar enzim-substrat yang sering digunakan
adalah coumarin Manafi, 1996. Substrat methylumbelliferyl bersifat larut air, sangat sensitif dan sangat spesifik. Karena sifatnya yang terpengaruh oleh pH,
terdifusi secara kuat ke media padat, dan perlu lampu UV untuk mendeteksi, maka penggunaan substrat in menjadi terbatas. Substrat fluorogenik yang paling umum
digunakan adalah MUG atau methylumbelliferyl glucuronidase Manafi, 2000. Secara umum reaksi yang terjadi pada media fluorogenik tampak pada
Gambar 1. Enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang tumbuh di media fluorogenik akan memecah ikatan komplek substrat karbohidrat dengan
methylumbelliferron. Gugus karbohidrat akan dipecah oleh enzim dan gugus methylumbelliferil akan dilepaskan ke media. Apabila disinari dengan lampu UV
panjang gelombang 365 nm atau 366 nm akan tampak sinar fluoresen biru pada media cair atau pada koloni terduga yang tumbuh di media agar Manafi, 1996;
Merck, 2004; APHA, 2005.
Media
Gambar 1 Skema umum reaksi enzim-substrat Methyl-umbelliferon pada media fluorogenik menghasilkan fluoresensi pada media cair dan koloni
dibawah lampu UV 366 nm
38 Media cepat yang dikembangkan dari media konvensional dengan
penambahan substrat fluorogenik MUG dapat digunakan untuk menumbuhkan, sekaligus membedakan E.coli dari bakteri lainnya. Contoh pengembangan media
konvensional menjadi media cepat fluorogenik dari adalah media VRBA with MUG APHA, 2005; FDA, 2002 dan media EC Broth with MUG APHA, 2005.
Dalam Manafi 2000 disebutkan jumlah MUG yang ditambahkan ke media konvensional adalah 50 µgml BGLB, LB, ECB, LTB, 100 µgml LTB, 150
µgml MCB, dan 200 µgml VRBA. Beberapa contoh media cair yang menggunakan MUG, yang tersedia
secara komersial di pasar adalah Fluorocult LMX Broth, Readycult Coliform, Colilert, Coliquick, dan Colisure Tabel 3. Selain itu beberapa contoh media
konvensional yang sudah mengandung MUG didalamnya adalah Fluorocult
®
LMX broth, Fluorocult
®
Lauryl Sulfate Broth, Fluorocult
®
BRILA Broth, Readycult
®
Coliform, Fluorocult
®
VRBA, Fluorocult
®
MacConkey Agar, Fluorocult
®
E.coli O157:H7 Merck, 2005.
Media Kromogenik
Substrate-enzim kromogenik adalah senyawa-senyawa yang bertindak sebagai substrat terhadap suatu enzim spesifik, dan berubah warna karena kerja
dari enzim tersebut. Secara umum, berdasarkan reaksi kimianya, empat kelompok senyawa kromogenik dapat dikenali dan dideskripsikan oleh Manafi pada tahun
1998. Turunan indolil bersifat larut air dan tahan panas sehingga bisa digunakan di media agar. Turunan indolil yang sering digunakan antara lain: 5-bromo-4-
chloro-3-indolyl X, 5-bromo-6-chloro-3-indolyl magenta, atau 6-chloro-3- indolyl salmon, dan semuanya terbukti tidak terdifusi di agar Manafi, 2000.
Manafi 2000 menyebutkan bahwa substrat kromogenik yang sering digunakan adalah ONPG o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside; Salmon-GAL 6-
bromo-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside; XGAL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß- D-galactopyranoside; XGLUC atau BCIG 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-
glucuronide; CPRG chlorophenol red ß-galactopyranoside; dan TTC Tryphenyl Tetrazolium Chloride.
39 Pada Gambar 2 terlihat reaksi umum dari enzim-substrat pada media
kromogenik. Enzim spesifik yang dilepaskan oleh suatu mikroorganisme akan menggunakan karbohidrat dari komplek karbohidrat-indolil yang ada di media
sebagai sumber karbon. Dua gugus indolil yang lepas akan saling berikatan, dan dengan adanya oksigen akan membentuk warna tertentu, tergantung jenis indolil
dari kromogen yang digunakan. Karena pembentukan warna memerlukan oksigen maka ketersediaan udara yang cukup di botol atau cawan petri menjadi sangat
penting Manafi, 1996; Manafi, 2000.
Gambar 2 Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik menghasilkan warna tertentu pada koloni.
Contoh media kromogenik yang sudah tersedia di pasar adalah yang menggunakan X-GAL sehingga memberikan warna biru Tabel 3 adalah
Fluorocult LMX Broth, Readycult Coliform Medium, EMX Agar, C-EC-MF Agar, Coli ID, Rapid E.coli 2, Coli Complete, ColiBag, Pathogel, dan E.colite. Media
kromogenik yang menggunakan ONPG sehingga memberikan warna kuning Tabel 3 adalah Colilert dan Coliquick. Substrat CRPG memberikan warna merah
digunakan pada media Colisure. Substrat lain yang juga memberikan warna merah adalah Salmon GAL, dan digunakan pada media Chromocult Coliform
Agar, CHROM Agar ECC, E coli Coliforms, Coliscan, HiChrom ECC.
Enzim Indolyl
Karbohidrat
Enzim Tak Berwarna
ikatan indolyl + O
2
warna
+ O
2
Glucuronide dan Galactoside
Enzim ß-D-glucuronidase dan ß-D-galactosidase
40
Media Simultan untuk Koliform dan E.coli
Baik koliform maupun E.coli sampai saat ini masih sangat penting sebagai indikator kualitas air dan produk pangan secara umum sehingga akan sangat
berguna apabila ada suatu media yang dapat mendeteksi keduanya sekaligus dalam waktu yang bersamaan. Beberapa percobaan telah dilakukan dan metode
baru sudah diperkenalkan yaitu yang berdasar pada deteksi enzim ß-D- galactosidase ß-GAL dan enzim ß-D-glucuronidase GUD menggunakan
substrat fluorogenik danatau khromogenik Manafi Rosmann, 1998b. Enzim ß-D-galactosidase ß-GAL yang dimiliki oleh 98 koliform Manafi, 1995.
Enzim ß-D-glucuronidase GUD yang dimiliki oleh 98 E.coli dan 99 E.coli memberikan reaksi indol positif Manafi, 1995 dan 1996. Akan tetapi ada 3-4
E.coli ternyata memiliki sifat MUG negatif dan GAL positif, misalnya E.coli O157 Merck, 2005.
Gambar 3 Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik dengan dua macam kromogen.
Enzim
Indolyl
Karbohidrat
Enzim
Tak Berwarna
+ O
2
Chloroindigo Bromochloroindigo
Coliforms dan
E.coli E.coli
X-Gluc dan Salmon GAL + E.coli
Glucuronidase dan Galactosidase
Glucuronide dan galactoside
41 Media yang digunakan untuk pengujian simultan koliform dan E. coli pada
Tabel 3 ada yang mengandung dua macam substrat kromogenik, ada pula yang mengandung kromogenik dan fluorogenik sekaligus. Untuk media yang
mengandung substrat kromogenik lebih dari satu maka akan tampak dua atau lebih warna koloni yang berbeda untuk jenis bakteri yang berbeda. Contoh dari
media tersebut adalah Chromocult
®
Coliform Agar, CHROM Agar ECC, E.coliColiforms, ColiScan, dan HiChrome ECC Salmon GAL-merah dan
XGLUC-violet; Coli ID dan Rapid E.coli 2 XGAL-biru dan Salmon Glu-rose violet; dan m-Coliblue TTC dan XGluc Manafi, 2000.
Contoh reaksi yang terjadi apabila menggunakan dua macam kromogen sekaligus ada pada Gambar 3, yaitu untuk media Chromocult
®
Coliform Agar. Pada gambar tersebut terlihat dua macam reaksi warna yang terjadi dari peruraian
enzim-substrat yaitu merah salmon dari enzim Galactosidase yang dimiliki oleh koliform dan E.coli dan hijau torquise dari enzim Glucuronidase yang dimiliki
oleh E.coli. E.coli menghasilkan kedua macam enzim sehingga akan terjadi warna purple yang merupakan campuran dari merah salmon dan hijau torquise
tersebut Manafi, 2000; Merck, 2004; Merck 2005. Dalam suatu kultur bakteri campuran, warna yang tampak untuk akan ada
empat macam, yaitu merah salmon untuk koliform GAL positif, purple GAL positif dan GUD positif untuk E.coli, hijau torquise untuk bakteri dengan sifat
GUD positif dan GAL negatif, serta koloni tak berwarna untuk Enterobacteriaceae lainnya Manafi, 2000; Merck, 2004; Merck 2005.
Kemungkinan kedua adalah media simultan yang menggunakan kombinasi kromogenik dan fluorogenik sekaligus. Pada media jenis ini maka selain timbul
warna spesifik juga muncul fluoresensi apabila dilihat dibawah lampu UV 366 nm. Media simultan yang sudah ada di pasaran antara lain tampak pada Tabel 3,
yaitu yang berbentuk media cair, berbentuk media padat, atau juga sistem lain. Yang berbentuk media cair adalah Fluororcult
®
LMX Broth, Readycult coliforms, ColiLert, Coliquick, Colisure. Yang berbentuk media padat adalah EMX –agar,
C-EC-MF-Agar, Chromocult Coliform Agar, Coli ID, CHROMagar ECC, Rapid’ E.coli 2, E.coliColiforms, ColiScan, MI-agar, dan HiCrome ECC.
42 Kelompok ketiga adalah yang menggunakan sistem lain yaitu, ColiComplete,
ColiBagWater check, Pathogel, E. colite, m-Coliblue Manafi, 2000. Tabel 3 Penggunaan berbagai substrat kromogenik dan fluorogenik dalam media
untuk deteksi E.coli dan koliform
Medium Substrat
a
Warna Manufaktur
Koliform E. coli
Media cair Fluororcult
®
LMX Broth XGALbiru-hijau MUGfluoresen biru
Merck Jerman Readycult Coliform
XGALMUG MUGfluoresen biru
Merck Jerman ColiLert
ONPGkuning MUGfluoresen biru
IDEXX USA Coliquick
ONPGkuning MUGfluoresen biru
Hach USA Colisure
CPRGmerah MUGfluoresen biru
IDEXX USA Media Padat
Fluorocult
®
Agars -
MUGfluoresen biru Merck Jerman
TBX Agar -
BCIGbiru OXOID UK, Merck
Jerman Uricult Trio
- HOQhitam
Orion Finnland EMX -agar
XGALbiru MUGfluoresen biru
Biotest Jerman C-EC-MF-Agar
XGALbiru MUGfluoresen biru
Biolife Italy Chromocult Coliform
Agar SalmonGalmerah XGLUCbiru-violet
Merck Jerman Coli ID
XGALbiru SalmonGlurose-violet
bioMerieux France CHROMagar ECC
SalmonGalmerah XGLUCpurple Chromagar France
Rapid’ E.coli 2 XGALbiru
SalmonGlupurple Sanofi France
E.coliColiforms SalmonGalmerah XGLUCpurple
OXOID UK, ColiScan
SalmonGalmerah XGLUCpurple MicrologyLab.USA
MI-agar MUGalfluoresen
biru Indoxylbiru
Brenner et al. 1993 HiCrome ECC
SalmonGalmerah XGLUCbiru Union Carbide
USA Sistem Lain
ColiComplete XGALbiru
MUGfluoresen biru Biocontrol USA
ColiBagWater check XGALbiru-hijau
MUGfluoresen biru Oceta Kanada
Pathogel XGALbiru
MUGfluoresen biru Charm Sci.USA
E. colite XGALbiru
MUGfluoresen biru Charm Sci.USA
m-Coliblue TTCmerah
XGLUCbiru Hach USA
a Singkatan: ONPG o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside; Salmon-GAL 6-bromo-3-indolyl- ß-D-galactopyranoside; XGAL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside; CPRG
chlorophenol red ß-galactopyranoside; XGLUC atau BCIG 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß- D-glucuronide; MUG 4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide; TTC Tryphenyl Tetrazolium
Chloride; HOQ Hydroxyquinoline-ß-D-glucuronide Sumber : Manafi, 2000
Beberapa aplikasi media kromogenik dan fluorogenik untuk mikrobiologi pangan dan air adalah untuk Enterobacteriaceae, Enterococci, Staphylococcus
aureus, Clostridium perfringens, Bifidobacteria dan Lactic acid bacteria, Listeria monocytogenes, dan Bacillus cereus. Yang paling banyak berkembang saat ini
adalah media untuk pengujian Enterobacteriaceae yang meliputi media untuk
43 koliform, E.coli, E.coli O157:H7, koliform dan E.coli secara simultan, dan
Salmonella Manafi, 2000.
2.5 Metode Pengujian Koliform dan E. coli.