Metode Pengujian Bakteri Koliform dan E.coli

35 2004. Koliform berasal dari lingkungan sedangkan koliform fekal dan E. coli berasal dari kotoran fekal hewan maupun manusia USEPA, 2001. Standar untuk air minum menurut KEPMENKES 907, Council Directive 9883EC maupun WHO adalah kandungan bakteri koliform maupun E. coli harus negatif dalam 100 ml sampel air minum Depkes, 2002; EC, 1998; dan WHO, 2004. USEPA 2001 mensyaratkan bahwa dalam satu bulan jumlah sampel yang positif koliform tidak boleh lebih dari 5 dari total sampel dan untuk system yang jumlah sampelnya kurang dari 40 per bulan maka tidak boleh lebih dari satu sampel yang positif koliform. Semua sampel yang positif koliform harus dianalisa E. coli atau koliform fekal cukup salah satu untuk menentukan apakah ada pencemaran dari fekal manusia atau hewan.

2.4 Metode Pengujian Bakteri Koliform dan E.coli

Salah satu alasan mengapa koliform total dan E.coli paling banyak digunakan sebagai bakteri indikator adalah karena cara pengujiannya yang relatif mudah dan cepat. Pengujian mikrobiologis mungkin memberikan akurasi hasil yang bervariasi karena pemilihan medium pertumbuhan dan temperatur inkubasi. Disamping itu, kondisi asal dan umur sampel air dapat mempengaruhi spesies yang terisolasi serta jumlahnya WHO, 2006. Media yang digunakan untuk pengujian koliform dan E. coli bisa media konvensional yang berbasis fermentasi karbohidrat atau media cepat yang berbasis fluorogenik danatau kromogenik. Media konvensional pada umumnya berdasarkan pada kemampuan bakteri koliform dalam memfermentasi laktosa oleh enzim ß-D-galactosidase, menghasilkan asam dan gas. Asam yang terbentuk akan mengubah indikator yang ada dalam media tersebut menjadi warna tertentu, baik pada media maupun pada koloni bakteri. Gas yang terjadi karena fermentasi laktosa akan ditangkap dengan tabung durham pada medium cair atau akan menimbulkan rekahan di media padat. Beberapa reaksi lain yang mungkin timbul sesuai komposisi medianya adalah terbentuknya kilap logam Endo Agar dan EMB agar atau terjadinya presipitat disekitar koloni pada Violet Red Bile Agar Manafi, 1996; Merck, 2005. Beberapa media konvensional yang umum digunakan yaitu Lactose Broth LB, Brilliant Green Bile 2 Broth BGLB, Lauryl Sulfate Tryptose 36 BrothLauryl Tryptose Broth LST, MacConkey Broth MCB, MacConkey Agar MCA, EC BrothMedium, Violet Red Bile Agar VRBA, Endo Agar, Eosin Methylen Blue Agar EMBA, Levine EMB Agar LEMBA, m-Endo Agar LES, A 1 Medium, dan P-A Broth APHA, 2005; ISO, 2004; Merck, 2005; USEPA, 2007. Secara umum, penggunaan media konvensional untuk pengujian bakteri indikator masih belum bisa membedakan antara bakteri laktose positif, bakteri kelompok koliform dan bakteri E. coli. Untuk membedakannya diperlukan tahapan identifikasi atau konfirmasi dari koloni terduga yang tumbuh di media agar untuk isolasi. Porses identifikasi tersebut selain memerlukan waktu yang banyak, juga memerlukan beberapa tahapan pengerjaan Manafi, 1996. Kebutuhan untuk mendapatkan hasil pengujian mikrobiologis secepatnya, terutama untuk produk pangan yang masa pakainya singkat, mendorong berbagai penelitian tentang media yang lebih cepat, praktis dan akurat. Beberapa media baru yang sesuai dengan kebutuhan tersebut sudah mulai diterima dan diakui oleh beberapa Lembaga Internasional seperti APHA, WHO, USEPA, ISO, dan FDA. Umumnya media yang digunakan adalah yang menggunakan enzim spesifik sebagai target penanda suatu mikroorganisme tertentu APHA, 2005; ISO, 2001; USEPA, 2007, WHO, 2002. Suatu mikroorganisme bisa mempunyai satu atau lebih enzim yang spesifik dan esklusif, yang dapat menggunakan substrat tertentu yang sesuai misalnya substrat-enzim fluorogenik dan khromogenik. Substrat tersebut dicampurkan kedalam media cair atau padat yang dipergunakan untuk menumbuhkan organisme tersebut. Penemuan substrat tersebut telah memicu pengembangan sejumlah besar metode untuk identifikasi mikroorganisme, bahkan untuk media isolasi awal. Penambahan substrat-enzim ini ke medium selektif dapat menghilangkan kebutuhan untuk subkultur dan test biokimia lanjutan untuk meyakinkan identitas suatu mikroorganisme tertentu Manafi, 1996; Manafi, 2000. 37 Enzim Methyl-umbelliferon Karbohidrat Enzim Tak Berwarna Fluoresens i Sinar UV 366 nm Enzim ß-D-Glucurondase Media Fluorogenik Media substrat-enzim fluorogenik umumnya mengandung substrat yang spesifik terhadap enzim tertentu seperti gula atau asam amino dan fluorogen seperti 4-methylumbelliferone, yang interaksinya dapat mengubah sinar UV menjadi sinar yang tampak. Sebagian besar enzim-substrat yang sering digunakan adalah coumarin Manafi, 1996. Substrat methylumbelliferyl bersifat larut air, sangat sensitif dan sangat spesifik. Karena sifatnya yang terpengaruh oleh pH, terdifusi secara kuat ke media padat, dan perlu lampu UV untuk mendeteksi, maka penggunaan substrat in menjadi terbatas. Substrat fluorogenik yang paling umum digunakan adalah MUG atau methylumbelliferyl glucuronidase Manafi, 2000. Secara umum reaksi yang terjadi pada media fluorogenik tampak pada Gambar 1. Enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang tumbuh di media fluorogenik akan memecah ikatan komplek substrat karbohidrat dengan methylumbelliferron. Gugus karbohidrat akan dipecah oleh enzim dan gugus methylumbelliferil akan dilepaskan ke media. Apabila disinari dengan lampu UV panjang gelombang 365 nm atau 366 nm akan tampak sinar fluoresen biru pada media cair atau pada koloni terduga yang tumbuh di media agar Manafi, 1996; Merck, 2004; APHA, 2005. Media Gambar 1 Skema umum reaksi enzim-substrat Methyl-umbelliferon pada media fluorogenik menghasilkan fluoresensi pada media cair dan koloni dibawah lampu UV 366 nm 38 Media cepat yang dikembangkan dari media konvensional dengan penambahan substrat fluorogenik MUG dapat digunakan untuk menumbuhkan, sekaligus membedakan E.coli dari bakteri lainnya. Contoh pengembangan media konvensional menjadi media cepat fluorogenik dari adalah media VRBA with MUG APHA, 2005; FDA, 2002 dan media EC Broth with MUG APHA, 2005. Dalam Manafi 2000 disebutkan jumlah MUG yang ditambahkan ke media konvensional adalah 50 µgml BGLB, LB, ECB, LTB, 100 µgml LTB, 150 µgml MCB, dan 200 µgml VRBA. Beberapa contoh media cair yang menggunakan MUG, yang tersedia secara komersial di pasar adalah Fluorocult LMX Broth, Readycult Coliform, Colilert, Coliquick, dan Colisure Tabel 3. Selain itu beberapa contoh media konvensional yang sudah mengandung MUG didalamnya adalah Fluorocult ® LMX broth, Fluorocult ® Lauryl Sulfate Broth, Fluorocult ® BRILA Broth, Readycult ® Coliform, Fluorocult ® VRBA, Fluorocult ® MacConkey Agar, Fluorocult ® E.coli O157:H7 Merck, 2005. Media Kromogenik Substrate-enzim kromogenik adalah senyawa-senyawa yang bertindak sebagai substrat terhadap suatu enzim spesifik, dan berubah warna karena kerja dari enzim tersebut. Secara umum, berdasarkan reaksi kimianya, empat kelompok senyawa kromogenik dapat dikenali dan dideskripsikan oleh Manafi pada tahun 1998. Turunan indolil bersifat larut air dan tahan panas sehingga bisa digunakan di media agar. Turunan indolil yang sering digunakan antara lain: 5-bromo-4- chloro-3-indolyl X, 5-bromo-6-chloro-3-indolyl magenta, atau 6-chloro-3- indolyl salmon, dan semuanya terbukti tidak terdifusi di agar Manafi, 2000. Manafi 2000 menyebutkan bahwa substrat kromogenik yang sering digunakan adalah ONPG o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside; Salmon-GAL 6- bromo-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside; XGAL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß- D-galactopyranoside; XGLUC atau BCIG 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D- glucuronide; CPRG chlorophenol red ß-galactopyranoside; dan TTC Tryphenyl Tetrazolium Chloride. 39 Pada Gambar 2 terlihat reaksi umum dari enzim-substrat pada media kromogenik. Enzim spesifik yang dilepaskan oleh suatu mikroorganisme akan menggunakan karbohidrat dari komplek karbohidrat-indolil yang ada di media sebagai sumber karbon. Dua gugus indolil yang lepas akan saling berikatan, dan dengan adanya oksigen akan membentuk warna tertentu, tergantung jenis indolil dari kromogen yang digunakan. Karena pembentukan warna memerlukan oksigen maka ketersediaan udara yang cukup di botol atau cawan petri menjadi sangat penting Manafi, 1996; Manafi, 2000. Gambar 2 Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik menghasilkan warna tertentu pada koloni. Contoh media kromogenik yang sudah tersedia di pasar adalah yang menggunakan X-GAL sehingga memberikan warna biru Tabel 3 adalah Fluorocult LMX Broth, Readycult Coliform Medium, EMX Agar, C-EC-MF Agar, Coli ID, Rapid E.coli 2, Coli Complete, ColiBag, Pathogel, dan E.colite. Media kromogenik yang menggunakan ONPG sehingga memberikan warna kuning Tabel 3 adalah Colilert dan Coliquick. Substrat CRPG memberikan warna merah digunakan pada media Colisure. Substrat lain yang juga memberikan warna merah adalah Salmon GAL, dan digunakan pada media Chromocult Coliform Agar, CHROM Agar ECC, E coli Coliforms, Coliscan, HiChrom ECC. Enzim Indolyl Karbohidrat Enzim Tak Berwarna ikatan indolyl + O 2 warna + O 2 Glucuronide dan Galactoside Enzim ß-D-glucuronidase dan ß-D-galactosidase 40 Media Simultan untuk Koliform dan E.coli Baik koliform maupun E.coli sampai saat ini masih sangat penting sebagai indikator kualitas air dan produk pangan secara umum sehingga akan sangat berguna apabila ada suatu media yang dapat mendeteksi keduanya sekaligus dalam waktu yang bersamaan. Beberapa percobaan telah dilakukan dan metode baru sudah diperkenalkan yaitu yang berdasar pada deteksi enzim ß-D- galactosidase ß-GAL dan enzim ß-D-glucuronidase GUD menggunakan substrat fluorogenik danatau khromogenik Manafi Rosmann, 1998b. Enzim ß-D-galactosidase ß-GAL yang dimiliki oleh 98 koliform Manafi, 1995. Enzim ß-D-glucuronidase GUD yang dimiliki oleh 98 E.coli dan 99 E.coli memberikan reaksi indol positif Manafi, 1995 dan 1996. Akan tetapi ada 3-4 E.coli ternyata memiliki sifat MUG negatif dan GAL positif, misalnya E.coli O157 Merck, 2005. Gambar 3 Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik dengan dua macam kromogen. Enzim Indolyl Karbohidrat Enzim Tak Berwarna + O 2 Chloroindigo Bromochloroindigo Coliforms dan E.coli E.coli X-Gluc dan Salmon GAL + E.coli Glucuronidase dan Galactosidase Glucuronide dan galactoside 41 Media yang digunakan untuk pengujian simultan koliform dan E. coli pada Tabel 3 ada yang mengandung dua macam substrat kromogenik, ada pula yang mengandung kromogenik dan fluorogenik sekaligus. Untuk media yang mengandung substrat kromogenik lebih dari satu maka akan tampak dua atau lebih warna koloni yang berbeda untuk jenis bakteri yang berbeda. Contoh dari media tersebut adalah Chromocult ® Coliform Agar, CHROM Agar ECC, E.coliColiforms, ColiScan, dan HiChrome ECC Salmon GAL-merah dan XGLUC-violet; Coli ID dan Rapid E.coli 2 XGAL-biru dan Salmon Glu-rose violet; dan m-Coliblue TTC dan XGluc Manafi, 2000. Contoh reaksi yang terjadi apabila menggunakan dua macam kromogen sekaligus ada pada Gambar 3, yaitu untuk media Chromocult ® Coliform Agar. Pada gambar tersebut terlihat dua macam reaksi warna yang terjadi dari peruraian enzim-substrat yaitu merah salmon dari enzim Galactosidase yang dimiliki oleh koliform dan E.coli dan hijau torquise dari enzim Glucuronidase yang dimiliki oleh E.coli. E.coli menghasilkan kedua macam enzim sehingga akan terjadi warna purple yang merupakan campuran dari merah salmon dan hijau torquise tersebut Manafi, 2000; Merck, 2004; Merck 2005. Dalam suatu kultur bakteri campuran, warna yang tampak untuk akan ada empat macam, yaitu merah salmon untuk koliform GAL positif, purple GAL positif dan GUD positif untuk E.coli, hijau torquise untuk bakteri dengan sifat GUD positif dan GAL negatif, serta koloni tak berwarna untuk Enterobacteriaceae lainnya Manafi, 2000; Merck, 2004; Merck 2005. Kemungkinan kedua adalah media simultan yang menggunakan kombinasi kromogenik dan fluorogenik sekaligus. Pada media jenis ini maka selain timbul warna spesifik juga muncul fluoresensi apabila dilihat dibawah lampu UV 366 nm. Media simultan yang sudah ada di pasaran antara lain tampak pada Tabel 3, yaitu yang berbentuk media cair, berbentuk media padat, atau juga sistem lain. Yang berbentuk media cair adalah Fluororcult ® LMX Broth, Readycult coliforms, ColiLert, Coliquick, Colisure. Yang berbentuk media padat adalah EMX –agar, C-EC-MF-Agar, Chromocult Coliform Agar, Coli ID, CHROMagar ECC, Rapid’ E.coli 2, E.coliColiforms, ColiScan, MI-agar, dan HiCrome ECC. 42 Kelompok ketiga adalah yang menggunakan sistem lain yaitu, ColiComplete, ColiBagWater check, Pathogel, E. colite, m-Coliblue Manafi, 2000. Tabel 3 Penggunaan berbagai substrat kromogenik dan fluorogenik dalam media untuk deteksi E.coli dan koliform Medium Substrat a Warna Manufaktur Koliform E. coli Media cair Fluororcult ® LMX Broth XGALbiru-hijau MUGfluoresen biru Merck Jerman Readycult Coliform XGALMUG MUGfluoresen biru Merck Jerman ColiLert ONPGkuning MUGfluoresen biru IDEXX USA Coliquick ONPGkuning MUGfluoresen biru Hach USA Colisure CPRGmerah MUGfluoresen biru IDEXX USA Media Padat Fluorocult ® Agars - MUGfluoresen biru Merck Jerman TBX Agar - BCIGbiru OXOID UK, Merck Jerman Uricult Trio - HOQhitam Orion Finnland EMX -agar XGALbiru MUGfluoresen biru Biotest Jerman C-EC-MF-Agar XGALbiru MUGfluoresen biru Biolife Italy Chromocult Coliform Agar SalmonGalmerah XGLUCbiru-violet Merck Jerman Coli ID XGALbiru SalmonGlurose-violet bioMerieux France CHROMagar ECC SalmonGalmerah XGLUCpurple Chromagar France Rapid’ E.coli 2 XGALbiru SalmonGlupurple Sanofi France E.coliColiforms SalmonGalmerah XGLUCpurple OXOID UK, ColiScan SalmonGalmerah XGLUCpurple MicrologyLab.USA MI-agar MUGalfluoresen biru Indoxylbiru Brenner et al. 1993 HiCrome ECC SalmonGalmerah XGLUCbiru Union Carbide USA Sistem Lain ColiComplete XGALbiru MUGfluoresen biru Biocontrol USA ColiBagWater check XGALbiru-hijau MUGfluoresen biru Oceta Kanada Pathogel XGALbiru MUGfluoresen biru Charm Sci.USA E. colite XGALbiru MUGfluoresen biru Charm Sci.USA m-Coliblue TTCmerah XGLUCbiru Hach USA a Singkatan: ONPG o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside; Salmon-GAL 6-bromo-3-indolyl- ß-D-galactopyranoside; XGAL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside; CPRG chlorophenol red ß-galactopyranoside; XGLUC atau BCIG 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß- D-glucuronide; MUG 4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide; TTC Tryphenyl Tetrazolium Chloride; HOQ Hydroxyquinoline-ß-D-glucuronide Sumber : Manafi, 2000 Beberapa aplikasi media kromogenik dan fluorogenik untuk mikrobiologi pangan dan air adalah untuk Enterobacteriaceae, Enterococci, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bifidobacteria dan Lactic acid bacteria, Listeria monocytogenes, dan Bacillus cereus. Yang paling banyak berkembang saat ini adalah media untuk pengujian Enterobacteriaceae yang meliputi media untuk 43 koliform, E.coli, E.coli O157:H7, koliform dan E.coli secara simultan, dan Salmonella Manafi, 2000.

2.5 Metode Pengujian Koliform dan E. coli.