43 koliform, E.coli, E.coli O157:H7, koliform dan E.coli secara simultan, dan
Salmonella Manafi, 2000.
2.5 Metode Pengujian Koliform dan E. coli.
Empat metode pengujian untuk bakteri koliform dan E.coli yang paling umum dilakukan adalah metode Angka Paling Mungkin Most Probable Number
atau Multiple-tube Fermentation Technique, metode Angka Koliform Total Total Coliform Count, metode Membrane Filtrasi Membrane Filtration
Technique, atau metode PositifNegatif Presence Absence Procedure melalui fase pendugaan–penegasan presuptive–confirmed phase atau test lengkap
APHA, 2005; Merck, 2004. Setiap teknik bisa diaplikasikan dalam keterbatasan spesifikasinya dan dengan memperhatikan tujuan pemeriksaan. Agar dapat
memberikan hasil yang valid maka diperlukan penerapan prosedur Quality Control yang ketat APHA, 2005. Beberapa metode acuan baik nasional maupun
internasional menggunakan beberapa metode sekaligus Tabel 4, sehingga pemakai dapat memilih metode yang cocok dengan jenis sampel dan situasi yang
ada di laboratoriumnya. Tabel 4 memberikan contoh beberapa metode pengujian koliform, E.coli
dan koli fekal beserta media yang digunakan, menurut referensi ISO, APHA, FDA, SNI, dan USEPA. USEPA tampaknya lebih cepat mengadopsi teknologi
kromogenik fluorogenik dengan mengakui penggunaan EC-MUG, LMX, Readycult Coliform, dan Chromocult Coliform Agar.
Angka Paling Mungkin
Angka Paling Mungkin APM atau Most Probable Number MPN atau Multiple Tube Technique adalah modifikasi dari Presence Absence Test PA.
Sampel yang ditambahkan dibagi ke beberapa tabung yang berbeda dengan volume larutan sampel yang sama Merck, 2005. Seri pengenceran tersebut
menghitung perkiraan konsentrasi mikroba dalam sampel sehingga disebut angka paling mungkin FDA, 2006. APM terutama cocok untuk sampel dengan
konsentrasi organisme yang rendah 100g, terutama susu dan air, dan untuk
44 pangan yang bahan-bahan yang terkandung di dalamnya mungkin akan
mengacaukan akurasi perhitungan koloni FDA, 2006. Tabel 4 Metode dan media yang digunakan dalam dalam beberapa metode
referensi untuk pengujian koliform, E.coli dan koli fekal
Metode Media Metode Standar
Koliform E.coli
Koli Fekal
Metode Angka Paling Mungkin LST = BGLB dan EC Broth
USEPA, FDA, APHA, SNI √
√ √
LST - MUG USEPA, FDA, APHA
√ √
Fluorocult LMX, Colilert USEPA
√ √
√
Metode Angka Lempeng Total Chromocult® Coliform Agar
USEPA, AOAC TBX Agar
ISO 16649-2:2001 √
VRBA ISO 4832, FDA, APHA
√ VRBA - MUG
FDA, APHA √
√
Metode Membran Filtrasi
m-Endo, LES-Endo, mFC, M-1 USEPA, APHA
√ Chromocult® Coliform Agar,
USEPA √
√
Metode Presence Absence P-A Broth = BGLB
USEPA, APHA √
LST = EC Broth USEPA
√ √
A-1 Broth direct media APHA
√ Readycult Coliform
USEPA Keterangan dari singkatan nama :
International Organization for Standardization ISO, 2001; American Public Health Association APHA, 2005; Food and Drug Association – Bacteriological Analytical Manual FDA, 2002;
United State Environment Protection Agency USEPA, 2007; Standar Nasional Indonesia SNI
Hanya mikroorganisme hidup yang terhitung dengan metode APM. Karena bakteri di dalam suatu sampel membentuk rantai yang tidak terpisahkan
selama persiapan sampel dan pengenceran, maka APM harus diputuskan sebagai perkiraan growth units GUs atau colony-forming units CFUs, bukan sebagai
individu bakteri FDA, 2006. Esensi dari metode APM adalah untuk mengencerkan sampel sampai ke suatu tingkat dimana inokula di dalam tabung
akan kadang kala, tetapi tidak selalu mengandung organisme hidup FDA, 2006. Dari jumlah tabung yang ada pertumbuhan pada setiap seri pengenceran
yang dihitung akan dibandingkan ke tabel tertentu sesuai dengan jenis seri pengenceran yang dipakai misal 3, 5, 8, dan 10 tabung FDA, 2006. Apabila
kemungkinan jumlah organisme dalam sampel sangat rendah maka jumlah sampel
45
a.Media Lauryl Sulfate Broth positif = gas dan keruh
b. Media Fluorocult LMX Broth
positif = warna hijau
diperbanyak 10 ml atau bahkan 100 ml kemudian ditambahkan ke medium double strength atau dengan volume yang setara Harrigan, 1998
Gambar 4 Pertumbuhan E.coli dalam media Lauryl Sulfate Broth dan Fluorocult
®
LMX Broth pada metode Angka Paling Mungkin Media yang umum digunakan untuk APM adalah Lactose Broth LB atau
Lauryl Sulfate Broth LSB untuk uji pendugaan koliform presumptive coliform. Apabila terjadi gas dan media menjadi keruh di LBLTB seperti di Gambar 4a,
maka dilakukan uji penegasan koliform confirmed coliform ke media Brilliant Green Bile 2 Broth BGLB dan uji pendugaan E. coli ke media EC Broth. Uji
penegasan E. coli dilakukan dengan menginokulasikan tabung EC broth positif ke media Levine EMB Agar. Dari hasil uji penegas yang positif kemudian dilakukan
inokulasi ke medium Nutrient Agar NA atau Plate Count Agar PCA untuk keperluan uji konfirmasi IMVIC APHA, 2005; FDA, 2006.
Beberapa media baru yang digunakan untuk APM adalah media yang mengandung fluorogenik, kromogenik atau keduanya. Beberapa media yang
mengandung fluorogenik misalnya EC-MUG APHA, 2005, Fluorocult
®
Lauryl Sulfate Broth, Fluorocult
®
Brilliant Green Lactose Broth Merck, 2005. Media yang lain mengandung baik fluorogenik dan kromogenik misalnya Fluorocult
®
LMX Broth. Hasil uji penduga positif apabila terjadi perubahan warna media
46 menjadi hijau kebiruan, yang biasanya mulai dari bagian atas tabung seperti
tampak di Gambar 4 b Manafi, 2000; Merck, 2004.
Angka Lempeng Total.
Angka Lempeng Total ALT atau Total Plate Count TPC merupakan metode perhitungan bakteri dengan menggunakan agar. Beberapa media yang
umum digunakan dalam ALT adalah Violet Red Bile Agar VRBA dan Fluorocult
®
VRBA. Metode internasional yang menggunakan VRBA antara lain American Public Health Association APHA, SMDP, International Dairy
Federation IDF, US Food and Drug Administration Bacteriology Analytical Manual FDA-BAM, International Standardisation Organisation ISO, BAM,
APHA. Beberapa media kromogenik yang bisa digunakan untuk ALT misalnya Chromocult
®
Coliform Agar, Chromocult
®
TBX Agar APHA, 2005; FDA, 2002; ISO, Merck, 2004.
Pada Gambar 5 terlihat pertumbuhan koliform di empat macam media yang berbeda, yaitu Chromocult
®
Coliform Agar CCA A, Violet Red Bile Agar VRBA B, ENDO Agar EA C, MacConkey Agar MCA D. Pada CCA
Gambar 5 A tampak koloni warna-warni yang membedakan antara koloni koliform warna merah salmon dan E.coli warna purple, sehingga untuk
perhitungan total koliform kedua warna tersebut dijumlahkan. Untuk media VRBA Gambar 5 B baik koliform dan E.coli semua warnanya sama yaitu koloni
merah dengan presipitat disekitar koloni yang berukuran 1-2 mm. Klebsiella yang termasuk golongan koliform dan bakteri Enterococci kadang-kadang tumbuh di
VRBA dengan bentuk koloni pink-point. Pada media Endo Agar Gambar 5 C koloni koliform dan E.coli juga berwarna sama yaitu merah, hanya untuk E.coli
ada kilap logamnya. Media ke empat yaitu MCA koliform dan E.coli yang bersifat positif laktosa akan berwarna merah dikelilingi oleh zone keruh karena presipitasi
asam bile sebagai akibat ari penurunan pH Merck, 2005. Dari keempat media tersebut hanya CCA yang mampu menumbuhkan sekaligus membedakan antara
koloni koliform dan E.coli, sehingga bisa digunakan sekaligus sebagai media untuk menumbuhkan, menghitung dan media seletif.
47
Gambar 5 Pertumbuhan E.coli dalam media Chromocult
®
Coliform Agar A, Violet Red Bile Agar B, ENDO Agar C, MacConkey Agar D
pada metode Angka Lempeng Total
Membran Filtrasi
Metode membran filtrasi biasanya digunakan untuk kualitas air minum atau air lain yang memiliki kandungan mikroorganisme sangat rendah.
Keuntungan penggunaan membran filtrasi adalah volume sampel yang ditest bisa sangat besar sehingga akurasi data lebih besar dari pada metode lain yang
sampelnya sangat terbatas. Media yang direkomendasikan oleh USEPA dan APHA untuk pengujian ini adalah M-Endo atau LES Endo kemudian di
konfirmasi ke LTB dan BGLB untuk Standar Methods SM 9222B,C; MI Medium Standar Methods SM 9222, m-Coliblue, Chromocult Coliform Agar, dan Coliscan
USEPA, 2007; APHA, 2005. Hasil pengujian dengan membran filtrasi tampak pada Gambar 6.
A B C D
48
Gambar 6 Pertumbuhan koloni pada metode pengujian Membran Filtrasi
Kelemahan metode membran filtrasi adalah apabila sampel banyak mengandung partikulat yang nantinya akan tertahan di membran dan berpotensi
mengganggu perhitungan koloni. Selain itu metode ini memerlukan investasi beberapa manifold dan pompa vakum untuk pelaksanaannya. Penggunaan jenis
membran yang tepat juga akan mempengaruhi hasil karena interaksi antara bahan kimia dari media dengan membran sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan
bakteri Ossmer et.al, 1999.
Presence Absence .
Metode Presence Absence PA untuk koliform adalah modifikasi sederhana dari metode APM. Penyederhanaan dilakukan dengan menggunakan
satu porsi besar 100 ml dalam botol kultur tunggal untuk mendapatkan informasi kualitatif, yaitu ada atau tidaknya koliform. Hal ini dijustifikasi oleh teori yang
ada bahwa dalam 100 ml sample air minum tidak boleh ada koliform sama sekali. Metode ini juga memungkinkan untuk dilakukannya. Metode PA membuka
kemungkinan untuk dilakukannya screening lanjutan untuk bakteri-bekteri indikator lain koliform fekal, Aeromonas, Staphylococcus, Pseudomonas,
Streptoccus fekal, dan Clostridium. Kelebihan lain adalah kemampuan dalam menganalisa jumlah sample yang lebih besar per satuan waktu pengujian APHA,
2005.
49
Inokulasi sampel
Koliform negatif
being atau keruh
Koliform positif
warna hijau
kebiruan E.coli positif warna hijau , Fluoresensi
positif, indol positif
Gambar 7. Metode Presence Absence menggunakan Readycult Coliform 100 Metode PA umumnya digunakan untuk sampel dengan kualitas
mikrobiologis yang sangat bagus dimana keberadaan mikroorganisme mustahil ada atau seharusnya tidak boleh ada, misalnya tidak boleh adanya negatif
koliform dan E.coli di sampel air minum. Kelemahan dari metode ini adalah apabila hasilnya positif maka tidak ada informasi kuantitatif tentang tingkat
kontaminasi yang terjadi. Sensitifitas dari metode ini sangat tergantung pada jumlah sampel yang dianalisa. Untuk air minum umumnya menggunakan sampel
100 ml, sedangkan untuk air minum yang dikemas maka sampel yang digunakan adalah 250 ml Codex, 2003; WHO, 2002.
Studi komparasi dengan metode membran filtrasi mengindikasikan bahwa PA bisa memaksimalkan deteksi koliform di sample yang mengandung macam-
macam organisme yang dapat menutupi overgrow koloni koliform dan menyulitkan deteksi. Apabila hasilnya positif maka dianjurkan untuk diuji ulang
dengan metode kuantitatif untuk menghitung jumlah koliformnya yang akan memberikan indikasi tingkat kontaminasi air APHA, 2005. Gambar 7
memberikan contoh metode PA menggunakan media Readycult Coliform dengan pembacaan hasil yang sama dengan media LMX yaitu warna hijau kebiruan untuk
koliform positif, dan E.coli positif warna hijau fluoresensi dan indol Merck, 2005; Manafi and Rossman, 1998.
50
III. BAHAN DAN METODE