79 Gambar 18 Pertumbuhan koloni Escherichia coli atypical di media Chromocult
Coliform Agar. Dalam penelitian ini memang tidak dibandingkan antara metode ALT
menggunakan media VRBA dan CCA karena tujuan utama adalah membanding- kan antara APM dengan ALT yang dalam hal ini diwakili oleh CCA
. Pemilihan
CCA sendiri seperti diterangkan diatas adalah karena beberapa keunggulan yang dimiliki CCA seperti ketelitian, kepraktisan dan kecepatan hasil. Penelitian yang
membandingkan VRBA dan CCA telah dilakukan oleh Gonzales et.al pada tahun 2003 pada sampel makanan siap saji ready-to-eat foods. Dari hasil penelitian
tersebut disimpulkan bahwa CCA memiliki beberapa keuntungan dibandingkan dengan VRBA yaitu hanya memerlukan satu medium untuk mendeteksi Koliform
dan E.coli, mengurangi biaya, mengurangi waktu secara nyata, dan mengurangi kecenderungan terjadinya kontaminasi silang dibanding metode-metode lainnya.
4.4 Metode Presence Absence.
Untuk sampel air yang sangat bersih seperti air minum atau air proses, yang jumlah bakterinya sangat kecil umumnya dianjurkan untuk menggunakan metode
membran filtrasi atau Presence Absence dengan jumlah sampel yang cukup besar, misalnya 100 ml. Dengan jumlah sampel yang besar diharap tingkat ketelitian dan
sensitifitas uji juga meningkat. Sebenarnya standar mikrobiologis air proses dan
80 air minum menurut Kepmenkes, WHO, FDA, dan USEPA adalah negatif atau nol
cfu per 100 ml sampel. Karena itu, untuk pengujian air minum umumnya metode yang disahkan adalah metode membran filtrasi atau PA yang memiliki tingkat
ketelitian lebih tinggi dari pada metode APM dan ALT Depkes, 2002; WHO, 2004; USEPA, 2007; FDA, 2002.
Dalam penelitian ini, metode APM yang sekarang digunakan dalam SNI dan metode ALT yang banyak digunakan di industri dibandingkan dengan metode
PA yang merupakan metode standar untuk pengujian air minum yang digunakan oleh USEPA. Metode membran filtrasi tidak dipilih karena jarang digunakan di
Indonesia dan memerlukan pengerjaan yang lebih rumit daripada metode PA. Metode Presence Absence PA pada penelitian ini menggunakan media
siap pakai Readycult
®
Coliform 100 RC 100 seperti pada Gambar 20. Media Readycult
®
Coliform 100 ini merupakan pengembangan dari media LMX Broth Tabel 7 menjadi bentuk siap pakai untuk metode Presence Absence dengan
sampel air sebanyak 100 ml Manafi and Rosmann, 1998a; Merck, 2005. RC 100 dibuat dari media Fluorocult
®
LMX Broth sebanyak 1.7 g, dikemas dalam sachet khusus dan disteril dengan cara radiasi Merck, 2005; Manafi, 2000.
Karena media sudah dalam keadaan ditimbang dan steril maka media bisa langsung dituang kedalam botol steril ukuran 250 ml yang sudah diisi dengan 100
ml sampel Gambar 19. Karena basis medianya sama, maka prinsip kerja media maupun cara pengamatan media RC adalah sama dengan LMX Broth.
Gambar 19 Cara penggunaan media cepat siap pakai Readycult
®
Coliform 100
81 Metode PA menggunakan media Readycult
®
Coliform 100 ini telah disahkan oleh USEPA untuk digunakan dalam pengujian bakteri Koliform
maupun E. coli dalam air minum USEPA, 2007. Keunggulan metode ini dibandingkan dengan APM maupun ALT adalah pengerjaannya yang jauh lebih
sederhana, cepat dan jumlah sampel yang dites jauh lebih besar daripada metode APM maupun ALT sehingga apabila ada satu sel saja dalam 100 ml sample akan
terdeteksi sebagai positif.
Tabel 12 Hasil pengujian Escherichia coli dengan metode Presence Absence pada media Readycult
®
Coliform 100
Sampel Kontrol positif
Sampel ber E. coli
Jenis Media
Ulangan Air
Proses Rendah
Sedang Tinggi
Rendah Sedang Tinggi
1 negatif
positif TD
TD positif
TD TD
2 negatif
positif TD
TD positif
TD TD
RC 100
3 negatif
positif TD
TD positif
TD TD
Catatan : -
Rendah konsentrasi cemaran 4 cfuml, Sedang 40 cfuml dan Tinggi 80 cfuml -
Keterangan : TD = Tidak dilakukan
Dari hasil penelitian terlihat bahwa semua sampel air proses tanpa cemaran adalah negatif dan semua sampel dengan cemaran maupun cemaran saja pada
konsentrasi rendah adalah positif Tabel 12. Pada penelitian ini metode PA hanya dilakukan untuk konsentrasi rendah saja untuk melihat sensitifitas pada
jumlah sel terendah, sedangkan untuk konsentrasi sedang dan tinggi tidak dilakukan karena sudah pasti akan positif hasilnya. Hasil ini sejalan dengan
kedua metode sebelumnya yaitu APM dengan LST maupun LMX dan ALT dengan CCA, dimana pada sampel air proses saja semua hasilnya negatif sedang
pada konsentrasi rendah semua positif dengan nilai cfu yang berbeda-beda. Apabila memang hasil akhir yang diinginkan hanya negatif per 100 ml sampel
maka diantara ketiga metode tersebut, metode PA lah yang paling sesuai karena paling mudah dilakukan, cepat dan dengan hasil yang sebanding dengan metode
lain. Manafi and Rosmann 1998a dalam penelitiannya mendapatkan hasil
bahwa Readycult
®
mendeteksi Koliform dan E.coli secara signifikan pada lebih
82 banyak sampel dalam 24 jam dibandingkan dengan standard Methods.
Readycult
®
menunjukkan hasil false positive untuk Aeromonas spp., yang merupakan waterborne bacteria yang umum. Deteksi Koliform dan E.coli
dikurangi menjadi total satu hari dibandingkan dengan metode EPA konvensional yang memerlukan 4 hari dan metode DIN yang memerlukan 3 hari. Selain itu
juga dibuktikan bahwa sensitifitas Readycult
®
sama dengan Standard Methods dan bahkan Readycult
®
dapat menghitung E.coli dan Koliform secara simultan dalam analisis yang sama. Efisiensi dan kecepatan reaksi yang dapat dideteksi
membuat media ini sangat bermanfaat dalam test mikrobiologi air rutin Manafi and Rosmann, 1998a.
Pada Gambar 20 tampak berbagai hasil inkubasi media Readycult
®
. Paling kiri yaitu yang berwarna bening kekuningan adalah pada saat awal inokulasi atau
apabila sampelnya steril. Botol yang tengah tampak keruh tetapi tidak berwarna biru kehijauan, yang berarti ada pertumbuhan bakteri tetapi bukan termasuk
Koliform. Hasil ini didapat dari inkubasi sampel air proses tanpa cemaran pada tanggal 3 Juni 2008, yang memang di media CCA juga tumbuh koloni tak
berwarna cukup banyak. Botol paling kanan keruh dan berwarna biru kehijauan, yang menunjukkan ada pertumbuhan bakteri Koliform dari perlakuan dengan
cemaran E.coli . Uji konfirmasi lanjutan untuk membedakan E.coli dari bakteri kelompok Koliform lainnya dilakukan dengan melihat fluoresensi dengan lampu
UV 366 nm dan pembentukan cincin merah dari reaksi indol dengan pereaksi KOVAC’s Gambar 21.
Keunggulan dan kelemahan media Readycult
®
dibandingkan dengan media konvensional untuk uji Koliform dan E.coli pada dasarnya sama dengan media
Fluorocult
®
LMX Broth yang telah diterangkan di bagian metode APM LMX. Keunggulan lainnya dari Readycult
®
adalah kemudahan dalam pengerjaan dan ketelitian yang lebih untuk uji air minum dengan jumlah bakteri Koliform sangat
kecil bahkan negatif, karena sampel yang diuji adalah 100 ml dalam satu botol.
83 Gambar 20 Pertumbuhan bakteri Koliform di media Readycult
®
Coliform 100
Gambar 21 Fluoresensi 1 dan Reaksi Indol 2 dalam media Readycult
®
Coliform 100. Kemudahan pengerjaan seperti sudah disinggung di bagian inokulasi,
terutama karena media sudah dalam dalam bentuk snap siap yang steril Gambar 19, dengan dua pilihan yaitu untuk keperluan sampel 50 ml atau 100 ml. Dengan
bentuk snap siap pakai tersebut proses preparasi media yang konvensionl seperti penimbangan, pelarutan, sampai dengan sterilisasi dan penyimpanan menjadi
1. awal inokulasi
2. ada pertumbuhan
bukan Koliform 3. positif
Koliform
1 2
84 hilang. Kebutuhan tenaga, peralatan, waktu pembuatan media dan ruang simpan
untuk media jadi juga menjadi sangat berkurang. Prosedur sederhana ini memungkinkan suatu laboratorium sederhana dengan peralatan dan kompetensi
personal minimal, bahkan di lapangan, bisa juga melakukan test rutin monitoring Koliform.
Bentuk snap dengan media steril juga memungkinkan dilakukannya pengujian dengan sampel air sebesar 100 ml karena tidak lagi diperlukan air
sebagai pelarut dalam proses pembuatan media. Apabila menggunakan media biasa maka untuk melakukan pengujian dengan sampel sebanyak 100 ml
diperlukan media sebanyak 50 ml dengan minimal 3 kali resep 3-fold Merck, 2005; APHA, 2005. Hal ini tentu akan sangat mengurangi biaya pengujian
dibandingkan dengan metode APM atau PA biasa. Karena metode ini sangat sensitif maka yang diuji hanya sampel tanpa
inokulasi dan cemaran yang konsentrasi rendah saja. Jumlah sel akhir per botol adalah 400 sel untuk konsentrasi rendah Tabel 12 karena jumlah inokulum 4 sel
ml sedangkan jumlah suspensi cemaran yang digunakan adalah 100 ml. Cemaran konsentrasi sedang dan konsentrasi tinggi tidak diuji karena sudah pasti hasilnya
akan positif karena menurut Manafi dan Rosmann 1998a apabila ada satu sel saja dalam 100 ml sampel yang akan memberikan hasil positif.
Selain untuk deteksi secara simultan Koliform dan E.coli, Readycult Coliform dapat juga digunakan untuk pengkayaan dalam cara deteksi E.coli
O157:H7 secara cepat dan mudah di sampel air. E.coli O157:H7 yang diduga ada di sampel yang diinokulasikan ke media RC yang berwarna hijau kebiruan tetapi
fluoresensi negatif dan indol positif dikonfirmasi dengan Singlepath E.coli O157 Bubert et.al, poster
4.5 Perbandingan antara APM, ALT, dan PA
