26 μgmL, 6 μgmL, 8 μgmL, 10 μgmL dan 12 μgmL. Kemudian dibuat spektrum
serapan, kemudian spektrum ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dan derivat kedua pada panjang gelombang 200-400 nm dengan
∆λ = 4nm.
3.6.4.2 Pembuatan Spektrum Serapan Derivatif Asam Sitrat
Dipipet Larutan Induk Baku asam sitrat konsentrasi 10000 μgmL sebanyak 0,2
mL; 0,3 mL; 0,4 mL; 0,5 mL dan 0,6 mL. Masing-masing dimasukkan kedalam labu tentukur 10 mL, diencerkan dengan HCl 0,1 N hingga garis tanda. Lalu
dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 200 μgmL, 300 μgmL, 400 μgmL, 500 μgmL dan 600 μgmL. Kemudian dibuat
spektrum serapan, kemudian spektrum ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dan derivat kedua pada panjang gelombang 200-400 nm
dengan ∆λ = 4nm.
3.6.5 Penentuan Zero Crossing
Penentuan zero crossing diperoleh dengan menumpangtindihkan spektrum serapan kafein dan asam sitrat dari berbagai konsentrasi larutan. Zero
Crossing setiap spektrum serapan kafein dan asam sitrat ditunjukkan oleh panjang gelombang yang memiliki serapan nol pada berbagai konsentrasi.
3.6.6 Penentuan Panjang Gelombang Analisis
Dibuat larutan kafein dengan konsentrasi 10 μgmL dan larutan asam
sitrat dengan konsentrasi 500 μgmL, serta larutan campuran kafein konsentrasi 10
μgmL dan asam sitrat konsentrasi 500 μgmL. Kemudian ketiga larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm. Selanjutnya
ditransformasikan menjadi spektrum serapan derivat pertama dan derivat kedua.
27 Spektrum serapan kafein dan asam sitrat serta campuran kafein dan asam sitrat
ditumpangtindihkan. Panjang gelombang analisis yang dipilih adalah pada saat serapan senyawa pasangannya nol dan serapan maksimum kafein dan asam sitrat
serta dan campuran kafein dan asam sitrat hampir sama atau persis sama, karena pada panjang gelombang tersebut dapat secara selektif mengukur serapan kafein
dan asam sitrat.
3.6.7 Pembuatan dan Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Kafein dan
Asam Sitrat
Dibuat larutan baku kafein d engan konsentrasi 4 μgmL, 6 μgmL, 8 μgmL,
10 μgmL dan 12 μgmL. Kemudian diukur serapan derivat kedua kafein pada panjang gelombang analisis kafein. Prosedur yang sama dilakukan juga pada asam
sitrat. Dibuat larutan baku asam sitrat dengan konsentrasi 200 μgmL, 300
μgmL, 400 μgmL, 500 μgmL dan 600 μgmL. Kemudian diukur serapan derivat kedua asam sitrat pada panjang gelombang analisisnya. Ditentukan persamaan
regresi linier kafein dan asam sitrat y = ax + b. Berdasarkan nilai serapan pada masing-masing panjang gelombang analisis kafein dan asam sitrat, dilakukan
perhitungan limit deteksi limit of detection, LOD dan limit kuantitasi limit of quantitation, LOQ. Untuk menentukan LOD dan LOQ dapat digunakan rumus
Harmita, 2004.
LOQ =
28 Keterangan : SB
= Simpangan baku LOD = Limit Of Detection, Batas deteksi
LOQ = Limit Of Quantitation, Batas kuantitasi
3.6.8 Penentuan Kandungan Kafein dan Asam Sitrat dalam Minuman
