Isolasi Minyak Atsiri Daun Attarasa dengan Alat Destilasi Stahl Pembuatan Edible Film Pati Tapioka yang diinkorporasi Minyak Atsiri Daun Attarasa Aktivitas Antibakteri Edible Film yang diinkorporasi Minyak Atsiri Daun Attarasa Perhitungan jumlah pertumbu

13 Jangka sorong 14 Hot plate stirer 15 Plat kaca 16 Inkubator Fisher Scientific 17 Oven Galencamp 18 Counter 19 mikrometer skup

3.3 Prosedur penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel 3.3.1.1 Penyediaan Daun Attarasa Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan attarasa [Litsea cubeba Lour. Pers.] yang diperoleh dari daerah Parsoburan, kabupaten Toba Samosir, Propinsi Sumatera Utara. Daun Attarasa dibersihkan dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di udara terbuka, lalu dihaluskan dengan blender.

3.3.1.2 Penyediaan Pati Tapioka

Pati tapioka diperoleh dari ubi kayu yang diparut lalu di tambahkan air dan di peras. Hasil perasan di diamkan hingga membentuk endapan lalu disaring. Kemudian endapan di keringkan di udara terbuka lalu di haluskan dan diayak Soegihardjo, 2005.

3.3.2 Isolasi Minyak Atsiri Daun Attarasa dengan Alat Destilasi Stahl

Sebanyak 60 gram daun Attarasa yang telah dikeringkan dan dihaluskan dimasukkan kedalam labu destilasi lalu ditambahkan air. Dirangkai alat destilasi Stahl lalu sampel didestilasi. Destilat yang diperoleh merupakan lapisan minyak dan air lalu dipisahkan dengan corong pisah. Untuk mengikat air yang kemungkinan ikut terbawa, ditambahakan Na 2 SO 4 anhidrat lalu disaring. Filtrat yang diperoleh di uji aktivitas antibakterinya.

3.3.3 Pengujian Aktivitas Antibakteri Minyak atsiri Daun Attarasa

Universitas Sumatera Utara

3.3.3.1 Pembuatan Media Nutrien Agar NA dan Inokulasi Bakteri

Sebanyak 2,3 gram NA dimasukkan dalam erlemeyer dan dilarutkan dengan 100 mL aquades. Lalu panaskan di atas hot plate sampai mendidih dan di sterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Lalu media dibagi dalam 10 tabung dan ditutup dengan kapas. Media dibiarkan memadat dengan cara memiringkan tabung. Bakteri diinokulasikan di atas permukaan media dengan metode gores lalu di inkubasi selama 24 jam pada suhu 32-34 C.

3.3.3.2 Pembuatan Media Mueller Hinton Agar MHA

Sebanyak 3,4 gram MHA dimasukkan dalam erlemeyer dan dilarutkan dengan 100 mL aquades. Lalu panaskan di atas hot plate sampai mendidih dan di sterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Kemudian media dituang ke dalam 10 cawan petri dan didinginkan sampai media memadat.

3.3.3.3 Pembuatan Suspensi Bakteri

Masing-masing inokulat Escherichia coli, shigella SP dan Staphylococcus aureus di ambil dengan jarum ose steril dan disuspensikan dengan aquadest steril lalu dihomogenkan dengan vortex hingga diperoleh suspensi sebanding kekeruhan Mcfarland yang sama dengan 10 8 kolonomL. Dari masing-masing suspensi bakteri diambil sebanyak 0,1 mL dan diencerkan dalam 9,9 mL aquades steril lalu di vortex sehingga konsentrasi suspensi bakteri menjadi 10 6 kolonimL.

3.3.3.4 Aktivitas Antibakteri Minyak atsiri Daun Attarasa

Uji aktivitas antibakteri dilakukan secara aseptik dengan metode difusi agar. Masing-masing suspensi bakteri di inokulasikan di atas permukaan media Mueller Hinton Agar MHA. Blankdisc yang telah di rendam dalam minyak atsiri daun attarasa dengan konsentrasi 15 vv dalam etanol absolut diletakkan di atas permukaan media yang telah di inokulasi dengan suspensi bakteri. Sebagai kontrol pada setiap cawan petri diletakkan blankdisc yang telah dibasahi etanol absolut. Kultur bakteri di inkubasi dalam inkubator dengan cara terbalik pada suhu 32-34 C selama 24 jam. Perlakuan dilakukan Universitas Sumatera Utara sebanyak 3 kali pada masing-masing bakteri. Di ukur zona antimikrobial yang terbentuk di sekitar cakram menggunakan jangka sorong.

3.3.4 Pembuatan Edible Film Pati Tapioka yang diinkorporasi Minyak Atsiri Daun Attarasa

Sebanyak 4 g pati tapioka ditambah 100 g aquadest lalu diaduk hingga rata. Campuran tersebut dipanaskan diatas hotplate stirer pada suhu 70 C hingga mengental dan ditambahkan 1g gliserol sambil tetap diaduk dan didinginkan pada suhu kamar. Lalu dimasukkan minyak atsiri daun attarasa dengan konsentrasi 1,5vw dari larutan pembentuk edible film dan dihomogenkan. Hasilnya dicetak diatas plat kaca 13 x 13 cm dan dikeringkan dalam oven pada suhu 30-35 C selama 20 - 24 jam. Di uji aktivitas antibakteri dari film yang terbentuk.

3.3.5 Aktivitas Antibakteri Edible Film yang diinkorporasi Minyak Atsiri Daun Attarasa

Uji aktivitas antibakteri dilakukan secara aseptik dengan metode difusi agar. Masing-masing suspensi bakteri di inokulasikan di atas permukaan media Mueller Hinton Agar MHA. Lalu edible film yang telah dipotong cakram dengan diameter 6 mm diletakkan di atas permukaan media yang telah di inokulasikan suspensi bakteri. Kultur bakteri di inkubasi dalam inkubator dengan cara terbalik pada suhu 32-34 C selama 24 jam. Di ukur zona antimikrobial yang terbentuk di sekitar cakram menggunakan jangka sorong.

3.3.6 Perhitungan jumlah pertumbuhan koloni bakteri dengan metode Standart Plate Count SPC

Potongan ikan gurami dibeli pada pasar lokal. Potongan ikan pertama dengan berat 10 g dibungkus dengan film pati tapioka yang di inkorporasi minyak atsiri daun attarasa dengan konsentrasi 1,5 vw dan potongan ikan kedua dengan berat 10 g tidak di bungkus sebagai kontrol. Masing-masing potongan ikan di tempatkan dalam cawan petri dan di simpan pada suhu 5 – 10 C selama 7 hari. Jumlah koloni bakteri pada masing-masing perlakuan dihitung dengan metode SPC pada hari ke 0, 1, 3, 5 dan 7. Dari potongan ikan diambil Universitas Sumatera Utara sebayka 1 g, dihaluskan lalu dimasukkan ke dalam tabung rekasi dan ditambah aquadest steril sampai volume 10 ml pengenceran 10 . Dari pengenceran tersebut diencerkan menjadi pengenceran 10 -1 dan dimasukkan sebanyak 1ml kedalam tabung reaksi yang telah dimasukkan 10 ml media plate count agar PCA lalu dihomogenkan dengan vortex dan dituang ke dalam cawan petri. Setelah media padat selanjutnya diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 32-34 C lalu dihitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada media tersebut. Universitas Sumatera Utara 3.4. Bagan Penelitian 3.4.1. Isolasi Minyak Atsiri dari Daun Attarasa dengan Alat Destilasi Stahl didestilasi dipisahkan dalam corong pisah ditambahkan Na 2 SO 4 anhidrat lalu disaring 3.4.2 Uji Aktivitas Antibakteri Minyak atsiri Daun Attarasa disuspensikan dalam aquadest steril dihomogenkan dengan vortex dibandingkan dengan kekeruhan Mcfarland yang setara dengan 10 8 CFUmL diencerkan dengan aquadest sampai kekeruhan 10 6 CFUmL Dibasahi dengan minyak atsiri konsentrasi 10 vv dan 15vv dalam etanol absolut diinokulasi di atas media MHA Di letakkan cakram yang telah dibasahi minyak atsiri diatas media MHA Di inkubasi secara terbalik dalam inkubator pada suhu 32-34 C selama 24 jam Di ukur diameter zona antibakteri disekitar cakram Biakan bakteri Escherichia coli, shigella dan Staphylococcus aureus Suspensi bakteri Media MHA Cakram basah Blankdisc Hasil Suspensi bakteri Serbuk Daun Attarasa Destilat Minyak atsiri masih mengandung sisa air minyak atsiri Uji aktivitas antibakteri Universitas Sumatera Utara

3.4.3 Pembuatan Edible Film Pati Tapioka yang diinkorpurasi Minyak Atsiri daun attarasa