Gambar 5. Skema proses peralatan ultrafiltrasi
3. Presipitasi bertingkat
a. Protease hasil ultrafiltrasi ditempatkan ke dalam labu erlenmeyer dan dikondisikan suhunya menjadi 4
o
C menggunakan balok es. b. Penambahan larutan amonium sulfat 30 bv jenuh dilakukan dengan
pengadukan dan dituang sedikit demi sedikit ke dalam larutan protein. Volume larutan amonium sulfat jenuh yang terbentuk dicatat. Proses
pengadukan membutuhkan waktu ± 60 menit, kemudian disimpan pada suhu 4
o
C selama semalam untuk menyempurnakan pengendapan. c. Endapan yang dihasilkan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000xg15
menit. Endapan kemudian dipisahkan dari cairannya. Cairan yang tersisa dicatat volumenya dan dilakukan presipitasi kembali dengan
menggunakan prosedur yang sama tetapi konsentrasi amonium sulfat yang lebih tinggi. Jumlah amonium sulfat yamg ditambahkan berdasarkan
Lampiran 14. Konsentrasi amonium sulfat yang digunakan adalah 30 - 70 amonium sulfat jenuh.
d. Tiap contoh yang dihasilkan pada tahap ini diukur unit aktivitas enzim dan kadar protein enzim.
4. Kromatografi penukar ion
Ada dua tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan separasi protein-protein dalam kromatografi kolom “Akta Prime”, yaitu penghilangan
garam-garam dengan menggunakan “Hi trap desalting” dan penukar ion. Laju alir yang digunakan adalah 1 mlmenit.
Gambar 6. Alat kromatografi kolom “Akta Prime”
1. Penghilangan garam-garam
a. Penyiapan contoh Contoh dilewatkan melalui filter berukuran 0,45 µm. Volume contoh
maksimal yang direkomendasikan dengan menggunakan kolom kromatografi ”HiTrap
TM
desalting” berukuran 5 ml adalah 1,8 ml. b. Penyiapan penyangga
Untuk memastikan hasil terbaik digunakan air dan bahan-bahan kimia dengan kadar kemurnian tinggi. Hal ini bertujuan untuk menyaring
penyangga dengan melewatkannya melalui filter 0,45 µm sebelum digunakan.
Penyangga portal A1 : sodium fosfat 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7. Sedikitnya 500 ml larutan penyangga disiapkan.
c. Pengaturan pemurnian a Pipa pemasukkan diletakkan pada portal A1 8 katup portal dan
portal B 2 katup portal di dalam penyangga. Tiga pipa
Kategori