yang tepat dan efektif karena kelarutannya yang tinggi, murah, rendahnya toksisitas terhadap sebagian besar enzim dan mempunyai efek menstabilkan pada
beberapa enzim Chaplin, 2004. Dua tata cara salting out yang umum digunakan. Pertama, larutan garam
jenuh ataupun kristal garam bubuk secara perlahan ditambahkan ke dalam campuran protein untuk meningkatkan konsentrasi garam didalam konsentrasi
campuran. Protein yang mengendap dikumpulkan dan dikelompokkan berdasarkan konsentrasi larutan garam pada saat terbentuk. Pengumpulan
sebagian produk yang terpisah ini dinamakan fraksinasi. Fraksi protein yang dikumpulkan selama tahap-tahap awal penambahan garam lebih sedikit dapat
larut dibandingkan fraksi yang dikumpulkan kemudian Wang, 2005. Bila metode pertama hanya menjelaskan penggunaan peningkatan
konsentrasi garam, metode alternatif berikutnya menggunakan pengurangan konsentrasi garam. Pada metode alternatif ini, sebanyak mungkin protein harus
dapat diendapkan dengan cepat oleh konsentrasi larutan garam. Kemudian rangkaian penurunan konsentrasi larutan amonium sulfat dingin digunakan untuk
mengekstrak komponen protein secara selektif, kebanyakan melarut pada konsentrasi amonium sulfat yang lebih tinggi. Protein yang diekstraksi
dikristalkan kembali dan kemudian diperoleh kembali melalui pemanasan bertahap larutan dingin menjadi suhu ruang Wang, 2005.
D. KROMATOGRAFI PENUKAR ION
Kromatografi umumnya dilakukan untuk memisahkan komponen- komponen zat di dalam bahan yang terikat satu sama lain. Pada dasarnya analisis
ini terdiri dari dua sistem yaitu fase tetap stationary phase dan fase bergerak mobile phase. Fase tetap berguna untuk mengikat komponen zat, sedangkan fase
bergerak berguna untuk mengangkut komponen zat lain yang tidak terikat. Oleh karena adanya sistem pengangkutan dan sistem pengikatan ini, maka suatu
komponen zat dapat dipisahkan dari komponen lainnya Suhartono, 1989.
Empat kromatografi yang sudah dikenal dan banyak digunakan, yaitu kromatografi kertas, kolom dan lapis tipis dengan pelarut cair sebagai fase
bergerak serta kromatografi gas dengan fase bergerak dalam bentuk gas. Pada penelitian ini kromatografi yang digunakan adalah metode penukar ion.
Menurut Lehninger 1988, kromatografi penukar ion merupakan metode yang paling banyak dipergunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan
menghitung jumlah tiap-tiap asam amino di dalam suatu campuran. Kromatografi penukar ion memanfaatkan perbedaan afinitas molekul bermuatan di dalam
larutan senyawa tidak reaktif yang berfungsi sebagai pengisi kolom yang bermuatan berlawanan. Golongan senyawa ini merupakan polimer yang bersifat
elastik, yang mengandung kerangka resin sintetik Suhartono, 1989. Beberapa dari 20 asam amino yang membangun blok protein memiliki
rantai sisi yang bermuatan. Pada pH 7,0; asam aspartat dan asam glutamat secara keseluruhan memiliki muatan negatif berada pada sisi kelompok asam, sedangkan
lisin, arginin dan histidin memiliki muatan positif berada pada sisi kelompok basa. Akibatnya, molekul protein memiliki muatan positif dan negatif, secara
garis besar disebabkan kehadiran beragamnya jumlah kelima asam amino Walsh, 2002.
Proses yang terjadi selama pertukaran ion secara umum dilakukan dalam empat tahap. Secara skematis dapat dilihat pada gambar 3.
Ta ha p I Ta ha p I I
Ta h a p I I I Ta ha p 4
Gambar 3. Pemisahan protein dengan prinsip kromatografi penukar ion http:www.chromatography.amershambiosciences.com
Tahap pertama adalah tahap penyeimbangan, pada tahap ini larutan penyangga A dipompa melalui kolom hingga pH dan konsentrasi garam mencapai
kondisi yang diinginkan. Selanjutnya adalah tahap aplikasi dan penyerapan contoh. Pada tahap tersebut, molekul terlarut membawa muatan yang sesuai untuk
menggantikan penukar ion dan mengikat secara dapat balik kepada gel. Senyawa yang tidak terikat akan tercuci keluar menggunakan larutan penyangga awalan
Amersham Pharmacia Biotech. Tahap ketiga adalah elusi gradien, senyawa dihilangkan dari kolom
dengan mengubah kepada kondisi elusi yang tidak cocok untuk ikatan ion molekul terlarut. Tahap ini dicapai dengan meningkatkan gradien konsentrasi
garam dan molekul terlarut tadi dikeluarkan dari kolom menurut kekuatan pengikatannya. Menurut Winarno 1997, ion Na
+
berkompetisi dengan protein untuk berikatan dengan gugus pada kolom dan secara bertahap ion Na
+
mengganti kedudukan protein.
Tahap terakhir sistem kromatografi ion ini adalah regenerasi, yaitu komponen bermuatan yang masih terdapat dalam kolom dicuci keluar sehingga
kondisinya kembali seperti semula Amersham Pharmacia Biotech.
E. AKTIVITAS ENZIM
