25
erlenmeyer diamati pertumbuhan sel dan dilakukan pengukuran Optical Density OD berdasarkan nilai Absorbansi setiap 1 jam hingga jam ke-
9 kemudian setiap 2 jam hingga jam ke-21. Pengukuran dilakukan hingga diperoleh nilai OD konstan menggunakan spektrofotometer UV-
VIS pada panjang gelombang 660 nm. Pengenceran dilakukan jika OD mendekati 1 atau lebih dari 1 untuk menghindari penyimpangan data
dikarenakan sampel yang terlalu pekat. Nilai Absorbansi A adalah nilai absorbansi yang terukur pada alat sedangkan Optical Density OD
adalah Nilai Absorbansi A dikalikan dengan faktor pengenceran. OD = A x FP
dimana OD
: Optical Density A
: Nilai Absorbansi FP
: Faktor Pengenceran
c. Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas Antimikroba
Tahap ini dilakukan dengan metode difusi agar dan metode kontak menggunakan supernatan yang telah dinetralkan untuk
mengetahui keberadaan senyawa antimikroba selain asam organik. Pada tahap ini kultur BAL yang telah diketahui kurva pertumbuhannya,
diinkubasi berdasarkan waktu yang diperlukan oleh tiap isolat untuk mencapai fase yang berkaitan erat dengan sintesis senyawa antimikroba
dalam fase pertumbuhannya. Pada metode difusi agar dalam tahap ini, diperlukan proses
pemisahan badan sel untuk pengujian supernatan bebas sel yang mengandung senyawa antimikroba. Isolat Bal diremajakan dalam 10 ml
MRSB selama 24 jam kemudian diinokulasikan ke dalam 50 ml MRSB dan diinkubasi sesuai dengan jangka waktu yang diperlukan kultur
tersebut untuk mencapai fase stasioner dari kurva pertumbuhannya. Supernatan bebas sel diperoleh dengan cara mensentrifugasi kultur cair
dengan kecepatan 8000 rpm, 4
o
C selama 15 menit. Selanjutnya supernatan yang diperoleh dinetralkan dan disaring
dengan milipore 0.22 µm. Filtrat yang dihasilkan kemudian diuji
26
aktivitasnya terhadap bakteri uji dengan metode difusi agar namun pada tahap ini jumlah bakteri uji yang terkandung dalam sumur agar adalah
10
6
sel per ml dan supernatan yang dimasukkan ke dalam sumur sebanyak 50 µl. Bakteri uji yang digunakan hanya gram positif yaitu
Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, dan Staphylococcus aureus. Zona bening Zona penghambatan yang terbentuk menunjukkan
adanya penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji oleh supernatan. Diameter zona penghambatan mm diukur dengan jangka
sorong sebanyak dua kali pada posisi yang berbeda dan dirata-ratakan Pada tahap ini juga dilakukan metode kontak. Isolat BAL
diremajakan dalam 10 ml media cair selama 24 jam kemudian diinokulasikan ke dalam 50 ml MRSB dan diinkubasi sesuai dengan
jangka waktu yang diperlukan kultur tersebut untuk mencapai fase stasioner dari kurva pertumbuhannya. Supernatan bebas sel diperoleh
dengan cara mensentrifugasi kultur cair dengan kecepatan 8000 rpm, 4
o
C selama 15 menit Kim et al., 2000. Selanjutnya supernatan yang diperoleh dinetralkan dan disaring dengan milipore 0.22 µm. Filtrat
yang dihasilkan diuji aktivitasnya hanya terhadap bakteri uji L. monocytogenes dengan metode kontak. Hasil metode kontak pada tahap
ini juga dianalisis dengan pengujian statistik ANOVA yang dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program SPSS untuk dibandingkan
dengan kontrol.
d. Konfirmasi Pengujian Bakteriosin
