IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi Fragmen DNA Penyandi CcGH Mature
Plasmid pGEM-T Easy yang mengandung cDNA GH ikan mas telah berhasil diisolasi. Hal ini ditunjukkan dengan adanya pita DNA pada ukuran 3648
bp pada gel elektroforesis pada Gambar 4.
Gambar 4. Hasil isolasi plasmid pGEM-T Easy yang mengandung cDNA CcGH;
M= marker, 1 dan 2= plasmid pGEM-T Easy; Tanda panah menunjukkan posisi 3,6 kb yang merupakan ukuran plasmid pGEM-T
Easy yang mengandung cDNA CcGH; angka di sebelah kiri merupakan ukuran marker
Setelah berhasil diverifikasi, selanjutnya plasmid pGEM-T Easy yang membawa cDNA GH ikan mas diamplifikasi dengan PCR untuk mengisolasi
fragmen GH mature ikan mas CcGH. Sinyal peptida pada cDNA GH ikan mas terdapat pada posisi asam amino ke-22 dan 23 Lampiran 2, sehingga nukleotida
ke-103 hingga ke-122 dijadikan sebagai primer forward untuk mengisolasi CcGH mature
. Berdasarkan analisis, dapat diketahui bahwa CcGH mature yang akan dihasilkan berukuran 579 bp. Hasil menunjukkan bahwa amplifikasi PCR untuk
mengisolasi fragmen DNA CcGH mature telah berhasil dilakukan yang ditunjukkan dengan adanya pita DNA yang muncul pada ukuran 579 bp Gambar
5.
Gambar 5. Hasil isolasi CcGH mature; M= marker, 1= CcGH mature, 2= full- length
CcGH; angka di sebelah kanan merupakan ukuran marker
2,5 - 3,0 -
4,0 - M
kb
- 0,5 - 0,7
- 1,0 kb
M 1
1 2
◄ 3,6 kb
2
15
4.2 Kloning Fragmen DNA Penyandi CcGH Mature ke Vektor pGEM-T
Easy
Fragmen DNA penyandi CcGH mature yang sebelumnya telah berhasil diamplifikasi dan diisolasi dari gel elektroforesis selanjutnya diligasi ke vektor
kloning pGEM-T Easy dan ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli DH5α.
Tahap ini bertujuan untuk memperbanyak sekuens CcGH mature secara in vivo yang selanjutnya CcGH mature akan diinsersikan kedalam vektor ekspresi yaitu
pCold I. Keberhasilan ligasi CcGH mature ke dalam vektor pGEM-T Easy Plasmid
yang dihasilkan selanjutnya disebut sebagai T-mCcGH dan transformasi plasmid T-mCcGH ke dalam E. coli
DH5α bisa diketahui dari perbedaan warna koloni bakteri yang tumbuh dan cracking. Bakteri yang mengandung plasmid T-mCcGH
akan berwarna putih, sedangkan bakteri yang mengandung vektor pGEM-T Easy tanpa insersi akan berwarna biru. Hal ini terjadi karena adanya marker LacZ yang
terdapat dalam vektor pGEM-T Easy. Marker ini akan bekerja apabila pada media tumbuh terdapat IPTG dan X-gal. Akan tetapi, adanya insersi gen CcGH mature
pada vektor pGEM-T Easy akan menonaktifkan gen LacZ sehingga X-gal yang terdapat pada media tumbuh tidak akan terurai menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-
kloroindigo dan menghasilkan koloni bakteri yang berwarna putih. Selanjutnya, bakteri putih yang ada diidentifikasi dengan metode cracking
untuk mengetahui apakah proses ligasi dan transformasi telah berhasil dilakukan. Seperti ditunjukkan pada Gambar 6 bahwa ukuran DNA dari bakteri hasil
transformasi plasmid memiliki ukuran lebih besar daripada plasmid kontrol pGEM-T Easy. Hal ini menunjukkan bahwa proses ligasi CcGH mature ke
dalam vektor pGEM-T Easy dan transformasi plasmid T-mCcGH kedalam bakteri telah berhasil dilakukan.
Gambar 6. Hasil cracking T-mCcGH dari bakteri konstruksi E. coli DH5α; T=
vektor pGEM-T Easy tanpa insersi, 1-5= hasil cracking klon bakteri E. coli
DH5α yang disisipi T-mCcGH; 3,0 kb merupakan ukuran vektor pGEM-T Easy tanpa insersi
3,0 kb - T
T 1 2 3 4 5
16 Hasil cracking menunjukkan bahwa sebagian besar koloni bakteri
membawa plasmid T-mCcGH. Hal ini terlihat dari munculnya pita DNA pada gel elektroforesis dan penambahan ukuran pita DNA jika dibandingkan dengan vektor
pGEM-T Easy tanpa insersi 3 kb. Koloni bakteri yang positif membawa plasmid T-mCcGH selanjutnya diremajakan pada media 2xYT yang telah ditambahkan
ampisilin untuk diperbanyak secara in vivo Gambar 7.
Gambar 7. Klon bakteri konstruksi E. coli DH5α yang membawa T-mCcGH
4.3 Isolasi Fragmen DNA Penyandi Fragmen CcGH Mature
Kategori