11
3.1.4 Ligasi
Tahap selanjutnya adalah ligasi fragmen DNA dengan vektor kloning pGEM-T Easy maupun vektor ekspresi pCold I. Komposisi reaksi ligasi meliputi
5 µL larutan DNA, 0,5 µL pGEM-T Easy ataupun pCold I, 6,5 µL 5x buffer ligasi, dan 1 µL enzim T4 DNA ligase Takara. Inkubasi dilakukan selama 2 jam
pada suhu ruang, kemudian hasil ligasi dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu 4°C.
3.1.5 Transformasi
Prosedur transformasi dilakukan mengikuti metode yang ada dalam Megawati 2008. Transformasi merupakan pengambilan materi genetik melalui
dinding sel yang menghasilkan penyatuan dan ekspresi dari materi genetik eksogenus. Transformasi dilakukan menggunakan kejutan panas pada suhu 42°C
selama 50 detik.
3.1.6 Cracking
Prosedur cracking dilakukan berdasarkan Megawati 2008. Prosedur ini bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri yang merupakan transforman dengan
cara mengeluarkan plasmid yang ditransformasikan ke dalam bakteri.
3.1.7 Produksi Protein GH dalam Bakteri E. coli
Koloni tunggal bakteri yang telah terinsersi vektor pCold I yang mengandung fragmen DNA GH mature dari biakan yang masih muda dipilih dan
diinokulasikan dalam 50 ml LB yang mengandung ampisilin dalam erlenmeyer 250 ml. Inokulan tersebut diinkubasi dalam shaker selama 16-18 jam dengan suhu
37°C. Kemudian dilakukan sub kultur sebanyak 1 dan ditumbuhkan kembali dalam 50 ml LB selama 2 jam. Selanjutnya, diberikan kejutan dengan
menggunakan suhu 15°C selama 30 menit. Setelah itu, biakan tersebut diberikan IPTG hingga konsentrasi akhir IPTG pada media 1 mM. Biakan tersebut
kemudian diinkubasi dalam shaker dengan suhu 15°C selama 24 jam. Setelah 24 jam, bakteri yang ada dikumpulkan dengan menggunakan sentrifugasi.
12
3.1.8 Ekstraksi Protein GH
Pellet bakteri E. coli BL21 yang sudah memproduksi rGH diresuspensi dengan menggunakan PBS yang mengandung 0,1 wv Triton X-100 kemudian
disonikasi 1 menit dihidupkan dan 1 menit dimatikan sebanyak 6 siklus dengan kekuatan maksimal. Suspensi yang ada kemudian disentrifugasi untuk
memisahkan bahan terlarut dan tidak terlarut. Supernatan yang terbentuk kemudian dibuang. Pellet yang terbentuk kemudian dibilas sebanyak 2 kali
dengan menggunakan 1 M NaCl yang megandung 1 wv Triton X-100 dan terakhir dibilas dengan menggunakan PBS. Badan inklusi yang mengandung rGH
selanjutnya dapat digunakan untuk dianalisa SDS-PAGE dan digunakan untuk uji bioaktivitas.
3.1.9 SDS-PAGE
Prosedur pengerjaan SDS-PAGE dilakukan berdasarkan metode Blackshear 1984 dalam Bollag et al. 1996. Konsentrasi gel acrylamid yang digunakan
adalah 10 dan menggunakan pewarnaan Coomasie brilliant blue. Marker ukuran protein yang digunakan adalah Pre Stained Protein Marker, Broad Range 7-175
kDa BioLabs, New England.
3.1.10 Uji Bioaktivitas rGH Ikan Mas
Kategori