20 sekuens CcGH mature telah berhasil diligasi ke dalam vektor pCold I. Perbedaan
1 yang terdapat dalam sekuens diduga terjadi akibat adanya variasi genetik pada template
yang digunakan.
4.7 Transformasi Plasmid C-mCcGH ke Bakteri E. coli BL21 DE3
Plasmid C-mCcGH yang telah berhasil diisolasi dari bakteri E. coli DH5α
dan urutan nukleotidanya memiliki tingkat kesamaan yang tinggi dengan sekuens Cc
GH mature selanjutnya ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli BL21 DE3 yang merupakan salah satu strain E. coli yang dapat digunakan sebagai host
ekspresi yang bagus. Strain ini memiliki defisiensi protease lon dan ompT. Protease lon berfungsi untuk mendegradasikan protein normal dan juga protein
yang tidak terlipat, sedangkan ompT merupakan protease yang terdapat pada membran terluar E. coli yang berfungsi untuk mendegradasi protein ekstraselular
BIOMOL 2004. Setelah ditransformasikan, bakteri E. coli BL21 DE3 yang diduga
membawa konstruksi plasmid C-mccGH ditumbuhkan pada media 2xYT yang telah ditambahkan ampisilin Gambar 13. Dari Gambar 13, dapat terlihat bahwa
ada banyak koloni bakteri yang diduga mengandung plasmid C-mCcGH karena dapat tumbuh pada media yang mengandung ampisilin. Selanjutnya, koloni
bakteri tersebut diidentifikasi dan diseleksi dengan menggunakan metode cracking
untuk mengetahui apakah koloni bakteri yang ada benar telah disisipi oleh plasmid C-mCcGH Gambar 14.
Gambar 13. Hasil transformasi plasmid C-mCcGH ke dalam E. coli BL21 DE3
21 Gambar 14. Hasil cracking C-mCcGH dari bakteri E. coli BL21 DE3; M=
marker, 1-16= hasil cracking klon bakteri E. coli BL21 DE3, √=
klon bakteri E. coli BL21 DE3 yang tersisipi oleh C-mCcGH; angka di sebelah kiri merupakan ukuran marker
Dari hasil cracking Gambar 14, koloni bakteri yang terindikasi positif membawa plasmid C-mCcGH selanjutnya diamplifikasi dengan menggunakan
primer forward pCold I dan primer reverse CcGHP-R untuk verifikasi arah orientasi penempelan fragmen CcGH mature pada vektor pCold I Gambar 15.
Berdasarkan pita DNA yang muncul, dapat diketahui bahwa ada 5 klon dengan arah orientasi yang benar, yaitu klon nomor 1, 2, 4, 5, dan 6.
Gambar 15. Hasil uji orientasi fragmen CcGH mature pada vektor pCold I; M= marker, 1-6= hasil PCR klon bakteri E. coli
BL21 DE3, √= klon bakteri E. coli BL21 DE3 dengan orientasi C-mCcGH yang benar;
angka di sebelah kanan merupakan ukuran marker
Bakteri E. coli BL21 DE3 yang membawa fragmen CcGH mature dengan orientasi yang benar selanjutnya ditumbuhkan pada media 2xYT yang telah
ditambahkan ampisilin Gambar 16.
M 1
2 3
4 5
6 7
8 9
10 11 12
13 14 15
16 kb
4,0 -
√ √ √ √
√
- 1,0 - 0,7
- 0,5
√ √
√ √
√
M 1
2 3
4 5
6 kb
22 Gambar 16. Klon bakteri E. coli BL21 DE3 yang membawa konstruksi plasmid
C-mCcGH
4.8 Ekspresi dan Analisis Protein rGH
