16 Hasil cracking menunjukkan bahwa sebagian besar koloni bakteri
membawa plasmid T-mCcGH. Hal ini terlihat dari munculnya pita DNA pada gel elektroforesis dan penambahan ukuran pita DNA jika dibandingkan dengan vektor
pGEM-T Easy tanpa insersi 3 kb. Koloni bakteri yang positif membawa plasmid T-mCcGH selanjutnya diremajakan pada media 2xYT yang telah ditambahkan
ampisilin untuk diperbanyak secara in vivo Gambar 7.
Gambar 7. Klon bakteri konstruksi E. coli DH5α yang membawa T-mCcGH
4.3 Isolasi Fragmen DNA Penyandi Fragmen CcGH Mature
Plasmid T-mCcGH yang berukuran 3,5 kb dan telah berhasil diperbanyak pada bakteri E. coli
DH5α kemudian diisolasi. Hasil isolasi plasmid tersebut selanjutnya dielektroforesis untuk mengetahui keberhasilannya Gambar 8. Dari
gambar tersebut bisa diketahui bahwa plasmid T-mCcGH telah berhasil diisolasi dari bakteri E. coli
DH5α.
Gambar 8. Elektroforesis plasmid T-mCcGH hasil isolasi dari bakteri E. coli DH5α; T-mCcGH= hasil isolasi plasmid T-mCcGH dari E. coli DH5
α, M= marker; angka di sebelah kanan merupakan ukuran marker Setelah berhasil diisolasi, plasmid T-mCcGH didigesti dengan
menggunakan enzim BamH I dan Sal I sesuai dengan situs restriksi yang telah disisipkan pada primer untuk mengisolasi fragmen DNA penyandi CcGH mature.
Setelah didigesti, dilakukan elektroforesis untuk mengetahui hasil digesti dan
- 3,0 - 2,5
M T-
mCcGH kb
- 4,0
17 mengisolasi fragmen CcGH mature Gambar 9. Hasil menunjukkan bahwa
digesti tersebut menghasilkan dua pita DNA; pita pertama merupakan fragmen plasmid pGEM-T Easy yang berukuran 3,0 kb dan pita kedua merupakan fragmen
Cc GH mature yang berukuran sekitar 0,5 kb.
Gambar 9. Hasil digesti plasmid T-mCcGH dengan enzim restriksi BamH I dan Sal
I; M= marker; hasil digesti menghasilkan dua pita DNA yaitu vektor pGEM-T Easy pada posisi 3,0 kb dan CcGH mature pada
posisi sekitar 0,6 kb; angka di sebelah kanan merupakan ukuran marker
4.4 Preparasi Vektor Ekspresi pCold I
Vektor pCold I yang akan digunakan sebagai vektor ekspresi merupakan vektor yang berbentuk sirkular. Oleh karena itu, sebelum disisipi oleh gen yang
akan digunakan CcGH mature, vektor ini perlu didigesti dengan menggunakan enzim restriksi yang terdapat pada multiple cloning site MCS vektor tersebut
tetapi tidak memotong sekuens CcGH mature. Berdasarkan hasil analisis menggunakan program GENETYX versi 7, akhirnya ditentukan dua enzim
restriksi yang digunakan yaitu BamH I dan Sal I. Penggunaan dua enzim restriksi tersebut bertujuan untuk menghasilkan fragmen yang berbentuk sticky end dan
ujung nukleotida yang berbeda sehingga lebih mempermudah penempelan fragmen CcGH mature dan vektor pCold I pada saat ligasi serta meminimalisir
kemungkinan fragmen CcGH mature tertempel dengan orientasi yang salah pada vektor pCold I. Hasil digesti vektor pCold I dengan menggunakan enzim BamH I
dan Sal I dapat dilihat pada Gambar 10.
4,0 - 3,0 -
1,0 - 0,5 -
◄ pGEM-T Easy
◄ CcGH mature M
kb
18 Gambar 10. Hasil digesti vektor pCold I; M= marker, 1= vektor pCold I yang
tidak didigesti, 2= vektor pCold I yang didigesti dengan enzim Bam
H I dan Sal I; angka di sebelah kiri merupakan ukuran marker Berdasarkan Gambar 10, diketahui bahwa digesti vektor pCold I telah
berhasil dilakukan. Hal ini terlihat dari perbedaan posisi pita DNA antara vektor pCold I yang tidak didigesti dengan vektor pCold I yang didigesti. Pita DNA
vektor pCold I yang didigesti lebih tinggi dibandingkan dengan vektor pCold I yang didigesti karena perbedaan bentuk keduanya. Vektor pCold I yang didigesti
berbentuk linear sedangkan vektor pCold I yang tidak didigesti berbentuk sirkular. Fragmen DNA yang berbentuk sirkular memiliki mobilitas yang lebih tinggi di
dalam gel agarosa dibandingkan dengan fragmen DNA yang berbentuk linear sehingga vektor pCold I yang didigesti terlihat memiliki ukuran yang lebih besar
bila dibandingkan dengan vektor pCold I yang tidak didigesti.
4.5 Kloning Fragmen DNA Penyandi CcGH Mature ke Vektor pCold I
