III. METODOLOGI
3.1 Prosedur
3.1.1 Isolasi Fragmen DNA Penyandi mGH
Fragmen DNA penyandi mGH ikan mas diisolasi dari cDNA full-length GH ikan mas yang ada dalam plasmid pGEM-T Easy koleksi laboratorium
menggunakan metode PCR. Amplifikasi PCR menggunakan primer forward Cc
GHMP- F 5’-GGATCC TCA GAC AAC CAG CGG CTC TTC-3’ dan reverse
Cc GHP-
R 5’-GTCGAC CTA CAG GGT GCA GTT GGA ATC CAG-3’. Nukleotida yang diberi garis bawah merupakan situs restriksi masing-masing
adalah BamH I dan Sal I yang berguna dalam proses pembuatan vektor ekspresi protein. Penentuan sekuens primer yang akan digunakan untuk mengisolasi CcGH
mature dibuat berdasarkan data Genbank M27000 Lampiran 1 dan selanjutnya
dianalisis dengan menggunakan program SignalP 3.0 Server pada situs http:www.cbs.dtu.dkservicessignalP
untuk menentukan sinyal peptida dan GENETYX versi 7.
Satu mikrogram plasmid yang mengandung cDNA full-length GH ikan mas digunakan sebagai cetakan untuk PCR, dicampur dengan 1 µl primer forward
maupun reverse 10 pmolµl, 1 µl dNTPs, 1 µl LA buffer, 0,05 µl LA Taq polymerase
Takara, 1 µl MgCl
2
kemudian ditambahkan SDW sampai volume akhir menjadi 10 µl. Proses PCR menggunakan program denaturasi awal pada
suhu 94°C selama 3 menit; 94°C selama 30 detik; 67°C selama 30 detik; 72°C selama 1 menit sebanyak 35 siklus; dan ekstensi akhir pada suhu 72°C selama 3
menit. Untuk mengklarifikasi hasil PCR, selanjutnya dilakukan elektroforesis.
Fragmen DNA mGH ikan mas sepanjang 579 bp. Selanjutnya, hasil PCR tersebut dapat digunakan sebagai gen yang akan diinsersi ke dalam vektor.
3.1.2 Preparasi Vektor
Sebanyak 3 μg pCold I yang akan digunakan dimasukkan ke dalam Eppendorf lalu dicampurkan dengan
3 μl 10x buffer enzim restriksi. Kemudian sebanyak 10-20 U BamH I dan Sal I dicampurkan dan ditambah dengan SDW
10 hingga
volume campuran mencapai 30 μl. Campuran ini diinkubasi pada suhu 37°C selama 2-4 jam. Selanjutnya, campuran ditambahkan dengan 0,05 unit
alkalin fosfatpmol akhir. Lalu dilarutkan dalam akuades sebelum digunakan. Larutan ini kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Selanjutnya,
dilakukan elektroforesis pada agarosa 1 hingga cukup jauh untuk memisahkan vektor linear yang tidak terdigesti. Setelah diamati dengan menggunakan UV
illuminator , bagian gel agarosa yang terdapat pita mengandung vektor yang sudah
didigesti dipotong lalu dimurnikan dengan menggunakan kit Mobio Ultra Clean™ 15 DNA Purification MoBio Laboratories, CA, USA. Vektor pCold I
yang sudah didigesti dengan enzim BamH I dan Sal I kemudian disimpan pada
suhu -20°C hingga akan digunakan. Vektor pGEM-T Easy yang akan digunakan sebagai vektor kloning dapat langsung digunakan untuk ligasi.
3.1.3 Pembuatan Sel Kompeten
Kategori