18 Gambar 10. Hasil digesti vektor pCold I; M= marker, 1= vektor pCold I yang
tidak didigesti, 2= vektor pCold I yang didigesti dengan enzim Bam
H I dan Sal I; angka di sebelah kiri merupakan ukuran marker Berdasarkan Gambar 10, diketahui bahwa digesti vektor pCold I telah
berhasil dilakukan. Hal ini terlihat dari perbedaan posisi pita DNA antara vektor pCold I yang tidak didigesti dengan vektor pCold I yang didigesti. Pita DNA
vektor pCold I yang didigesti lebih tinggi dibandingkan dengan vektor pCold I yang didigesti karena perbedaan bentuk keduanya. Vektor pCold I yang didigesti
berbentuk linear sedangkan vektor pCold I yang tidak didigesti berbentuk sirkular. Fragmen DNA yang berbentuk sirkular memiliki mobilitas yang lebih tinggi di
dalam gel agarosa dibandingkan dengan fragmen DNA yang berbentuk linear sehingga vektor pCold I yang didigesti terlihat memiliki ukuran yang lebih besar
bila dibandingkan dengan vektor pCold I yang tidak didigesti.
4.5 Kloning Fragmen DNA Penyandi CcGH Mature ke Vektor pCold I
Fragmen DNA penyandi CcGH mature yang sebelumnya telah berhasil diisolasi dari vektor pGEM-T Easy selanjutnya diligasi dengan vektor pCold I
yang telah didigesti dengan menggunakan enzim yang sama plasmid yang dihasilkan selanjutnya disebut sebagai C-mCcGH. Selanjutnya, konstruksi
plasmid C-mCcGH ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli DH5α untuk
diperbanyak secara in vivo. Bakteri hasil transformasi yang tumbuh kemudian diidentifikasi dengan metode cracking Gambar 11.
3,0 - 2,0 -
4,0 - kb
M 1
2
19 Gambar 11. Hasil cracking C-mCcGH dari bakteri konstruksi E. coli
DH5α; T= vektor pGEM-T Easy tanpa insersi, 1-5= hasil cracking klon bakteri
E. coli DH5α, √= klon bakteri E. coli DH5α yang tersisipi oleh C-
mCc GH
Berdasarkan hasil cracking Gambar 11 diketahui bahwa cukup banyak koloni bakteri yang membawa plasmid C-mCcGH. Hal tersebut bisa dilihat dari
ukuran pita DNA 3 koloni yang lebih besar bila dibandingkan dengan vektor pCold I tanpa insersi. Selanjutnya, koloni bakteri yang positif membawa plasmid
C-mCcGH diremajakan pada media 2xYT yang telah ditambahkan ampisilin Gambar 12.
Gambar 12. Klon bakteri konstruksi E. coli DH5α yang membawa plasmid C-
mCc GH
4.6 Isolasi Plasmid C-mCcGH dan Analisis Urutan Nukleotida
Plasmid C-mCcGH diisolasi dari bakteri E. coli DH5α dan selanjutnya
dilakukan sekuensing untuk menganalisa urutan nukleotidanya. Urutan nukleotida dari plasmid C-mCcGH yang disekuensing dapat dilihat pada Lampiran 3 dan
Lampiran 4. Selanjutnya, hasil urutan nukleotida yang diperoleh disejajarkan dengan sekuens CcGH mature dengan menggunakan program GENETYX versi 7
Lampiran 5. Hasil pensejajaran urutan nukleotida plasmid C-mCcGH memiliki tingkat kesamaan 99 dengan sekuens CcGH mature. Hal ini menandakan bahwa
√ √ √
T 1
2 3
4 5
T
20 sekuens CcGH mature telah berhasil diligasi ke dalam vektor pCold I. Perbedaan
1 yang terdapat dalam sekuens diduga terjadi akibat adanya variasi genetik pada template
yang digunakan.
4.7 Transformasi Plasmid C-mCcGH ke Bakteri E. coli BL21 DE3
