10 hingga
volume campuran mencapai 30 μl. Campuran ini diinkubasi pada suhu 37°C selama 2-4 jam. Selanjutnya, campuran ditambahkan dengan 0,05 unit
alkalin fosfatpmol akhir. Lalu dilarutkan dalam akuades sebelum digunakan. Larutan ini kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Selanjutnya,
dilakukan elektroforesis pada agarosa 1 hingga cukup jauh untuk memisahkan vektor linear yang tidak terdigesti. Setelah diamati dengan menggunakan UV
illuminator , bagian gel agarosa yang terdapat pita mengandung vektor yang sudah
didigesti dipotong lalu dimurnikan dengan menggunakan kit Mobio Ultra Clean™ 15 DNA Purification MoBio Laboratories, CA, USA. Vektor pCold I
yang sudah didigesti dengan enzim BamH I dan Sal I kemudian disimpan pada
suhu -20°C hingga akan digunakan. Vektor pGEM-T Easy yang akan digunakan sebagai vektor kloning dapat langsung digunakan untuk ligasi.
3.1.3 Pembuatan Sel Kompeten
Koloni tunggal bakteri E. coli DH5α maupun BL21 DE3 tergantung
vektor yang akan digunakan dikultur dalam 25 ml 2xYT kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 16-18 jam. Kemudian dilakukan sub kultur sebanyak 1
dan ditumbuhkan kembali dalam 25 ml 2xYT lalu diinkubasi selama 3 jam. Selanjutnya, biakan bakteri tersebut disimpan dalam wadah yang berisi es selama
30 menit, diambil 1,5 ml, lalu dimasukkan ke dalam Eppendorf dan disentrifugasi pada 5000 rpm selama 2 menit. Supernatan yang ada kemudian dibuang. Kedua
langkah sebelumnya diulang sebanyak 2 kali. Pellet yang ada dalam Eppendorf kemudian dicuci dengan menggunakan 1 ml NaCl mix dingin dan disentrifugasi
selama 2 menit pada 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk kemudian dibuang dan ditambahkan CaCl mix dingin sebanyak 1 ml lalu dibiarkan selama 20 menit
dalam wadah yang berisi es. Selanjutnya, disentrifugasi kembali selama 2 menit pada 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk kemudian dibuang dan pellet yang ada
disuspensikan dengan 200 μl CaCl mix. Campuran tersebut diinkubasi dalam es selama 20 menit-1 jam. Sel kompeten siap untuk digunakan.
11
3.1.4 Ligasi
Tahap selanjutnya adalah ligasi fragmen DNA dengan vektor kloning pGEM-T Easy maupun vektor ekspresi pCold I. Komposisi reaksi ligasi meliputi
5 µL larutan DNA, 0,5 µL pGEM-T Easy ataupun pCold I, 6,5 µL 5x buffer ligasi, dan 1 µL enzim T4 DNA ligase Takara. Inkubasi dilakukan selama 2 jam
pada suhu ruang, kemudian hasil ligasi dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu 4°C.
3.1.5 Transformasi
Prosedur transformasi dilakukan mengikuti metode yang ada dalam Megawati 2008. Transformasi merupakan pengambilan materi genetik melalui
dinding sel yang menghasilkan penyatuan dan ekspresi dari materi genetik eksogenus. Transformasi dilakukan menggunakan kejutan panas pada suhu 42°C
selama 50 detik.
3.1.6 Cracking
Prosedur cracking dilakukan berdasarkan Megawati 2008. Prosedur ini bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri yang merupakan transforman dengan
cara mengeluarkan plasmid yang ditransformasikan ke dalam bakteri.
3.1.7 Produksi Protein GH dalam Bakteri E. coli
