Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi Kolom

2.3.2 Kromatografi

Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri atas dua fase atau lebih. Salah satu fase bergerak secara bersinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya, zat-zat terlarut menunjukkan perbedaan mobilitas yang disebabkan oleh perbedaan adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion Harmita, 2014.

2.3.2.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi adsorbsi dan adsorben bertindak sebagai fase stasioner. Kromatografi lapis tipis thin layer chromatography atau TLC dapat digunakan untuk memisahkan berbagai senyawa seperti ion-ion anorganik, kompleks senyawa-senyawa organik baik yang terdapat di alam dan senyawa-senyawa sintetik.Metode pemisahan ini merupakan metode fisikokimia yang didasarkan atas penyerapan, partisi pembagian, atau gabungannya Harmita, 2009. Ada empat jenis adsorben yang biasa digunakan yaitu silika gel, alumina, kieselguhr, dan selulosa. Dari keempat adsorben tersebut yang paling banyak dipakai adalah silika gel. Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas ialah karena dapat dihasilkannya pemisahan yang sempurna, kepekaan yang lebih tinggi, dan dapat dilaksanakan dengan lebih cepat Adnan, 2010 . Sebelumnya kromatografi lapis tipis, kromatografi poliamida, dan elektroforesis kertas merupakan merupakan kelompok teknik pemisahan untuk senyawa fenolik. Kromatografi lapis tipis merupakan analisis yang bagus untuk flavonoida hal ini dikarenakan adanya cincin fenil yang merupakan gugus kromofor yang aktif akan UV serta menyebabkan flavonoid sangat mudah dideteksi Andersen, 2006 dan penggunaanya dalam penelitian ini yaitu dapat berguna untuk menentukan kondisi percobaan kromatografi kolom. Universitas Sumatera Utara

2.3.2.2 Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan peralatan yang sangat penting dalam pemisahan flavonoida. Adapun fase diam yang pada umumnya digunakan dalam kromatografi kolom yaitu silika gel, sephadex, polyamida dan selulosa dimana fase gerak yang biasa digunakan yaitu campuran antara pelarut organik polar dan pelarut organik nonpolar dengan menggunakan metode elusi gradient Bhat, 2005. Mekanisme pemisahan pada kromatografi kolom didasarkan pada adsorbsi komponen-komponen campuran yang memiliki afinitas yang berbeda-beda pada permukaan fase diam. Interaksi antara adsorben dan komponen-komponen campuran harus bersifat reversible. Aliran fase gerak akan membawa komponen- komponen campuran dengan kecepatan yang berbeda-beda sesuai dengan afinitas komponen tersebut terhadap adsorben. Komponen yang memiliki afinitas paling kecil akan bergerak lebih cepat. Pemisahan yang terjadi bergantung pada jenis fase gerak yang digunakan. Bila fase gerak yang digunakan sekaligus merupakan larutan campuran yang dipisahkan, kecuali eluat pertama, eluat sebelumnya selalu mengandung komponen dari eluat sebelumnya. Jadi komponen yang dipisahkan tidak murni. Bila eluen berupa larutan dari zat yang lebih kuat terikat pada adsorben, komponen-komponen yang dipisahkan lebih murni dan keluar secara beruntun dari kolom. Adapun prosedur yang dilakukan dalam kromatografi kolom yaitu: Diawali tahap penyiapan kolom, kolom diisi homogen dengan adsorben yaitu dengan mencampurkan adsorben dengan pelarut hingga membentuk bubur slurry, kemudian dituangkan ke dalam kolom yang berisi pelarut. Campuran diaduk didalam kolom untuk membantu homogenitas dan menghilangkan gelembung-gelembung udara. Sebelum dan selama proses pemisahan, permukaan kolom harus tetap terendam dalam pelarut dan ketinggian pelarut ± 1 cm diatas permukaan kolom. Kemudian tahap pemasukkan sampel ke permukaan kolom. Kolom dicuci dengan eluen, kemudian sampel yang telah dilarutkan dengan sejumlah kecil volume eluen dimasukka kemudian kran dibuka dengan hati-hati. Dalam kromatografi kolom perbandingan berat adsorben dengan sampel yaitu 30:1 dan perbandingan panjang dan diameter kolom 10-15:1 Universitas Sumatera Utara Setelah pemasukkan sampel terjadi proses elusi atau pemisahan komponen-komponen sampel. Elusi diteruskan hingga komponen-komponen terpisah atau hingga tiap-tiap komponen keluar dari kolom. Untuk senyawa yang tidak berwarna, eluat dipisahkan dalam beberapa fraksi, yang masing-masing dengan volume kecil dan penetapan tiap tiap fraksi. Dan tahap yang terakhir yaitu deteksi atau penetapan kadar komponen. Dimana senyawa kemudian ditetapkan dan ditimbang setelah fraksi diuapkan dengan uji bercak, KKt atau KLT atau dengan spektrofotometri Harmita, 2009.

2.3.2.3 Kromatografi Lapis tipis Preparatif