Setelah pemasukkan sampel terjadi proses elusi atau pemisahan komponen-komponen sampel. Elusi diteruskan hingga komponen-komponen
terpisah atau hingga tiap-tiap komponen keluar dari kolom. Untuk senyawa yang tidak berwarna, eluat dipisahkan dalam beberapa fraksi, yang masing-masing
dengan volume kecil dan penetapan tiap tiap fraksi. Dan tahap yang terakhir yaitu deteksi atau penetapan kadar komponen. Dimana senyawa kemudian ditetapkan
dan ditimbang setelah fraksi diuapkan dengan uji bercak, KKt atau KLT atau dengan spektrofotometri Harmita, 2009.
2.3.2.3 Kromatografi Lapis tipis Preparatif
Pada KLT preparatif, sampel dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat pelarut yang baik yang digunakan yaitu pelarut non polar seperti n-
heksana, diklorometana, etil asetat. Jika pelarut digunakan sedikit polar akan terjadi pelebaran pita Hostettman, 1995.
Sampel yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi plat lapisan dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis sampel sehingga
campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Penampakan pita dilakukan dengan cara yang tidak merusak senyawa yang tidak berwarna dan penjerap yang
mengandunng pita dikerok dari plat kaca kemudian sampel dielusi dengan penjerap dengan pelarut polar Gritter, 1991.
2.4 Teknik Spektroskopi
2.4.1 Spektrofotometer Ultraviolet-Visibel UV-Vis
Spektrum UV-Visibel merupakan hasil interaksi antara radiasi elektromagnetik REM dan molekul. REM merupakan bentuk energi radiasi yang mempunyai
sifat gelombang dan partikel foton Harmita,2009. Flavonoid dapat diidentifikasi dengan mudah dengan menggunakan
metode spektroskopi salah satunya adalah spektrofotometer Ultraviolet UV. Spektrofotometer Ultraviolet biasanya digunakan untuk mengkarakterisasi dan
mengidentifikasi tipe-tipe flavonoid. Spektra UV-Vis dari tiap pigmen tumbuhan akan berbeda dikarenakan kromofor yang berbeda-beda.
Kebanyakan flavonoid digolongkan dalam dua kelompok absorbsi, yang pertama dalam range panjang gelombang 240-285 nm pita II dan yang kedua
dalam 300-400 nm pita I . Pita II menunjukkan hasil serapan dari sistem benzoil
Universitas Sumatera Utara
cincin A sedangkan pita I merupakan hasil absorpsi dari sistem sinamoil cincin B Bhat,2005. Berikut rentangan serapan spektrum UV-Visibel golongan
flavonoida pada tabel 2.1 Markham, 1988. Tabel 2.1 Rentangan Serapan Spektrum UV-Visibelgolongan Flavonoida
No Pita II nm
Pita I nm Jenis Flavonoida
1 250-280
310-350 Flavon
2 250-280
330-360 Flavonol 3-OH tersubstitusi
3 250-280
350-385 Flavonol 3-OH bebas
4 245-274
310-330 bahu Isoflavon
5 275-295
300-330 bahu Flavanon dan dihidroflavonol
6 230-270
340-390 Khalkon
7 230-270
380-430 Auron
8 270-28
465-560 Antosianidin dan antosianin
2.4.2 Spektrofotometer Infra Merah FT-IR
Spektrum inframerah suatu molekul adalah hasil transisi antara tingkat energi getaran vibrasi yang berlainan. Inti-inti atom yang terikat oleh ikatan kovalen
mengalami getaran vibrasi atau osilasi oscillation. Bila molekul menyerap radiasi inframerah, energi yang diserap menyebabkan kenaikan dalam amplitudo
getaran atom-atom yang terikat itu. Jadi molekul ini berada dalam keadaan vibrasi tereksitasi excited vibrational state; energi yang diserap akan dibuang dalam
bentuk panas bila molekul itu kembali ke keadaan dasar Supratman, 2010 . Dua molekul senyawa yang memiliki struktur kimia yang berbeda akan
memiliki spektrum inframerah yang berbeda. Hal ini dapat dikarenakan kedua molekul tersebut memiliki jenis ikatan dan dan frekuensi vibrasi yang berbeda.
Walaupun memiliki jenis ikatan yang sama, ikatan-ikatan tersebut berada dalam dua senyawa yang berbeda sehingga mempunyai frekuensi vibrasi yang berbeda
karena kedua ikatan yang sama tersebut berada dalam lingkungan yang berbeda. karena itu tipe ikatan yang berlainan menyerap radiasi inframerah pada
panjang gelombang yang berlainan . Dengan demikian spektrometri inframerah dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya gugus fungsi dalam suatu
molekul seperti OH, NH
2
, aromatik, substitusi aromatik, -NO
2
, -SO
2,
-asetilen. Terdapat dua tipe vibrasi molekul yaitu Stretching vibrasi regangulur
yaitu vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi perpanjangan atau pemendekatan
Universitas Sumatera Utara
ikatan dan bending vibrasi lenturtekuk yaitu vibrasi yang disebabkan oleh sudut ikatan sehingga terjadi pembesaran atau pengecilan sudut ikatan. Gerakan vibrasi
yang diamati dalam spektrum inframerah jika menghasilkan perubahan momen dipol sedangkan jika ยต=0 akan teramati dalam spektrum raman.
Frekuensi molekular dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu penggandengan vibrasi, ikatan hidrogen, efek induksi, efek resonansi mesomeri,
sudut ikatan dan efek medan.Dalam spektrum inframerah juga perlu diperhatikan letak frekuensi, bentuk pita melebar atau tajam, dan intensitas pita kuat,
sedang, lemah karena merupakan petunjuk sangat berharga dalam mengidentifikasikan gugus fungsi yang terdapat dalam spektrum Harmita, 2009.
2.4.3 Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton
