3.3.4. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 7:3 vv
.
Dalam hal ini prosedur yang dilakukan yaitu dimasukkan 10 ml eluen ke dalam chamber, lalu dijenuhkan. Ditotolkan fraksi positif FeCl
3
5 fraksi 18-122 yang sebelumnya sudah dilarutkan dengan etil asetat pada batas
bawah plat KLT. Kemudian ditunggu hingga plat kering dan dimasukkan plat KLT tersebut kedalam chamber yang telah jenuh. Setelah eluen merembes sampai
batas atas plat KLT , plat KLT kemudian dikeluarkan dari chamber, dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl
3
5 dan menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida. Kemudian ditentukan harga RF
dari tiap noda dan digabungkan tiap fraksi dari botol vial yang memiliki harga Rf yang sama dan pola noda yang sama yaitu fraksi 18-23, fraksi 24-39, fraksi fraksi
40-54, fraksi 55-88, fraksi 89-102 dan fraksi 103-122. Kemudian gabungan fraksi 40-54 di KLT kembali dan terdapat 3 noda pada plat KLT dan menunjukkan
senyawa belum murni kemudian dilakukan pemurnian dengan KLT preparatif.
3.3.5 Pemurnian Hasil Isolasi
3.3.5.1 Pemurnian Hasil Isolasi Dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Setelah dilakukan kromatografi lapis tipis dan pada kromatogram terdapat 3 noda pada gabungan fraksi 40-54, selanjutnya dimurnikan dengan cara kromatografi
lapis tipis preparatif. Kristal hasil isolasi dari kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan etil asetat kemudian ditotolkan pada plat KLT yang berukuran
20x20 cm yang telah diberi batas atas dan batas bawah, kemudian noda dikeringkan dan ditotolkan lagi berulang dengan cara penotolan horizontal lalu
dikeringkan kembali sampai benar-benar terserap silika pada plat KLT yang digunakan.
Universitas Sumatera Utara
Dimasukkan plat KLT pada chamber yang berisi perbandingan pelarut yang sesuai untuk menaikkan noda yaitu digunakan petroleum benzena : aseton
70 : 30 vv pada
saat mencapai batas atas plat KLT diangkat dan didiamkan kemudian dimasukkan kembali sampai 2 kali pemasukkan plat kedalam chamber
agar noda-noda benar-benar terpisah dengan baik, kemudian diangkat dan dikeringkan, plat disinari dengan lampu UV kemudian ditandai noda yang
terpisah kemudian dikeruk dengan menggunakan alat pengeruk dan dimasukkan kedalam corong kaca kecil yang bawahnya telah dibuat kapas sebagai
penyaringan kemudian diekstraksi pada bagian atas corong menggunakan pelarut metanol : etil asetat 1 : 1 dibiarkan sampai filtratnya habis turun, filtrat yang
ditampung dimurnikan dengan penguapan kembali pelarut sampai terbentuk pasta, kemudian di KLT kembali untuk melihat apakah senyawa hasil isolasi sudah
murni menghasilkan 1 noda, ada adsorpsi pada sinar UV dan positif dengan pereaksi FeCl
3
.
3.3.5.2 Pemurnian
Senyawa yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etil asetat diaduk sehingga semua padatan larut sempurna. Kemudian etil asetat diuapkan sampai
sedikit saja tertinggal, lalu ditambahkan n-heksana, yang mana tidak dapat melarutkan senyawa yang diisolasi, secara perlahan-lahan sehingga terjadi
pengendapan senyawa didasar wadah. Kemudian didekantasi larutan bagian atas wadah, lalu diuapkan sisa pelarut dari yang masih tertinggal sehingga diperoleh
senyawa yang benar-benar bebas dari pelarut berupa pasta berwarna merah kecoklatan.
Universitas Sumatera Utara
3.3.6 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi