Penyediaan Sampel Uji Flavonoida Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT

3.2 Bahan-Bahan

- Daun mawar putih - Metanol Destilasi - N-heksana Teknis - Etil asetat Teknis - Aquadest Teknis - Aseton ProAnalis - Klorofom Teknis - Silika gel 40 KGaA - FeCl 3 5 - Plat KLT silika 60 F 254 - Kapas - Petroleum Benzene ProAnalis - Kertas saring biasa - Pereaksi Benedict

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1. Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan mawar putih yang diperoleh dari daerah Berastagi, Kabupaten Karo, Sumatera Utara. Daun Mawar putih dikeringkan diudara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun Mawar putih sebanyak 1080 g.

3.3.2. Uji Flavonoida

Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun bunga mawar putih maka akan dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut; 10 g serbuk daun mawar putih yang telah dikeringkan kedalam dua gelas erlenmeyer lalu ditambahkan 100 mL metanol kedalam gelas erlenmeyer I dan 100 mL etil asetat ke dalam gelas erlenmeyer II. Universitas Sumatera Utara Didekantasi lalu dibagi masing-masing ekstrak sampel kedalam 2 tabung reaksi. Untuk ekstrak metanol dan etil asetat : a. Tabung I ekstrak metanol : dengan FeCl 3 5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II ekstrak etil asetat : dengan FeCl 3 5 menghasilkan larutan berwarna hitam

3.3.3 Ekstraksi

Ekstraksi dilakukan terhadap daun tumbuhan bunga mawar putih sebanyak 1080 g, dimana daun mawar putih yang telah dikering anginkan dan dihaluskan. Kemudian dimaserasi dengan menggunakan metanol sebanyak 15 Liter sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ± 24 jam. Perendaman dilakukan secara berulang-ulang hingga ekstrak menunjukkan hasil negatif dengan menggunakan perekasi FeCl 3 5. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan pada penangas air hingga semua pelarut metanol menguap dan dihasilkan ekstrak pekat berwarna hitam.

3.3.3.1 Pemisahan Tanin

Ekstrak pekat metanol dari daun tumbuhan bunga mawar putih yang telah diuapkan hingga pelarut metanol habis menguap, kemudian dilarutkan dengan pelarut etil asetat untuk memisahkan tannin dan flavonoida, tannin merupakan senyawa polifenol yang tidak larut dalam pelarut polar aprotik, misalnya etil asetat. Kemudian disaring dan filtrat yang didapatkan dirotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat etil asetat bebas tannin berwarna hitam sebanyak 87,4248 g. Universitas Sumatera Utara

3.3.3.2 Ekstraksi Partisi dengan n-heksana

Ekstrak pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol kembali yang bertujuan untuk ekstraksi partisi dengan menggunakan n-heksana. Pada ekstraksi partisi syaratnya yaitu pelarut harus tidak bercampur agar terbentuk 2 lapisan, sehingga digunakan metanol karena metanol tidak bercampur dengan n-heksana. Ekstrak kemudian dipartisi dengan pelarut n-heksana berkali-kali hingga diperoleh ekstrak metanol bebas nonpolar flavonoida glikosida. Kemudian ekstrak metanol diuapkan kembali hingga seluruh pelarut menguap dan dihasilkan ekstrak pekat metanol bebas nonpolar berwarna hitam sebanyak 40,39 g.

3.3.3.3 Hidrolisa

Ekstrak pekat metanol bebas tannin dan bebas nonpolar flavonoida glikosida dihidrolisa yang bertujuan untuk memutuskan ikatan gula pada senyawa flavonoida dengan menggunakan HCl 6. Ekstrak pekat metanol bebas tannin dan bebas nonpolar dilarutkan dengan HCl 6 dengan perbandingan sampel adalah 2:5 kemudian ditambahkan aquadest lalu dipanaskan diatas waterbath selama 60 menit, setelah air mendidih lalu disaring untuk memperoleh filtrat yang dimana merupakan aglikon flavonoida Mabry et al, 1970.

3.3.3.4 Ekstraksi Partisi dengan Kloroform

Filtrat yang sudah bebas gula diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang-ulang hingga saat diuji lapisan kloroform dengan menggunakan pereaksi FeCl 3 5 menunjukkan hasil negatif, kemudian didapatkan ekstrak kloroform dan dipekatkan kembali dan dipanaskan diatas penangas hingga seluruh pelarut kloroform habis menguap sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1,1561 g. Universitas Sumatera Utara

3.3.3.5 Pemisahan Komponen-Komponen dengan Kromatografi Kolom

Pemisahan komponen-komponen secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel dan fasa gerak yaitu n-heksana 100 , campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 vv , 80:20 vv, 70:30 vv, 60:40 vv . Dirangkai alat kolom kromatografi terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan dalam kolom kromatografi . Ekstrak pekat klorofom dilarutkan dengan etil asetat lalu dicampurkan dengan silika gel. Kemudian pelarut etil asetat diuapkan pada penangas air sampai etil asetat menguap, lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20 vv, 70:30 vv, 60:40 vv. Eluat yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 10 ml dan diperoleh 122 botol vial. Kemudian diuji dengan FeCl 3 dan yang menunjukkan hasil positif fraksi 18 – 122 selanjutnya di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama serta pola noda yang sama fraksi 40-54. Kemudian diuapkan dan ditimbang. Pasta yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan etil asetat lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum dan mencari fasa gerak yang sesuai untuk preparatif KLT. Universitas Sumatera Utara

3.3.4. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT

Uji kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 7:3 vv . Dalam hal ini prosedur yang dilakukan yaitu dimasukkan 10 ml eluen ke dalam chamber, lalu dijenuhkan. Ditotolkan fraksi positif FeCl 3 5 fraksi 18-122 yang sebelumnya sudah dilarutkan dengan etil asetat pada batas bawah plat KLT. Kemudian ditunggu hingga plat kering dan dimasukkan plat KLT tersebut kedalam chamber yang telah jenuh. Setelah eluen merembes sampai batas atas plat KLT , plat KLT kemudian dikeluarkan dari chamber, dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 5 dan menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida. Kemudian ditentukan harga RF dari tiap noda dan digabungkan tiap fraksi dari botol vial yang memiliki harga Rf yang sama dan pola noda yang sama yaitu fraksi 18-23, fraksi 24-39, fraksi fraksi 40-54, fraksi 55-88, fraksi 89-102 dan fraksi 103-122. Kemudian gabungan fraksi 40-54 di KLT kembali dan terdapat 3 noda pada plat KLT dan menunjukkan senyawa belum murni kemudian dilakukan pemurnian dengan KLT preparatif.

3.3.5 Pemurnian Hasil Isolasi