PENINGKATAN KADAR LOVASTATIN ANGKAK MELALUI KO-KULTUR

64

5. PENINGKATAN KADAR LOVASTATIN ANGKAK MELALUI KO-KULTUR

Monascus purpureus DENGAN Endomycopsis burtonii Abstrak Peningkatan produksi lovastatin pada fermentasi angkak dipelajari melalui ko-kultur M. purpureus 10 7 cfuml dengan Endomycopsis burtonii khamir amilolitik terseleksi, pada berbagai konsentrasi 10 3 -10 5 cfuml dan waktu penambahan 2, 4, dan 6 hari. Perlakuan ko-kultur dengan E. burtonii mampu meningkatkan kadar lovastatin secara signifikan pada angkak yang diproduksi oleh strain-strain M. purpureus JmbA5K, AID, JmbA dan TOS. Produksi lovastatin tertinggi dihasilkan oleh strain M. purpureus TOS pada penambahan E. burtonii 10 4 cfuml pada hari ke 6 dengan fermentasi selama 14 hari, yaitu sebesar 2,2. Key words : Lovastatin, angkak, Monascus purpureus, Endomycopsis burtonii PENDAHULUAN Monascus purpureus merupakan fungi yang tidak patogen dan sudah lama digunakan untuk produksi pigmen angkak Chiu et al 2006; Lee et al 2006. Selama fermentasi angkak selain pigmen, juga diproduksi metabolit sekunder lain yaitu lovastatin. Lovastatin merupakan bahan bioaktif kelompok statin yang sangat penting dalam perkembangan biomedis. Lovastatin sudah lama digunakan sebagai senyawa penurun kolesterol dengan melakukan penghambatan enzim HMG-CoA reduktase 3-hidroksi metilglutaril CoA reduktase yang berperan penting dalam biosintesis kolesterol. Penelitian-penelitian yang dilakukan untuk produksi lovastatin pada angkak selama ini dilakukan secara monokultur menggunakan spesies-spesies Monascus Lee at al. 2006b; Miyake et al. 2005; Su et al. 2003; Astuti 2004. Kandungan lovastatin angkak yang dihasilkan masih relatif rendah, berkisar antara 0.2-0.9. Upaya meningkatkan kadar lovastatin angkak, telah dilakukan oleh Astuti 2004 dengan mempelajari pengaruh penambahan Tween 80 ke dalam substrat beras putih dan beras merah. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa Tween 80 mampu meningkatkan kadar lovastatin baik pada beras putih 0.16 dibandingkan kontrol 0.14 maupun 65 pada beras merah 0.26 dibandingkan dengan kontrol 0.09. Produksi lovastatin dalam angkak masih potensial untuk ditingkatkan. Salah satu upaya adalah dengan melakukan ko-kultur M. purpureus dengan menggunakan khamir indigenus penghasil amilase. Danuri 2008 melaporkan, enzim amilase sebagai enzim hidrolitik, dapat meningkatkan hidrolisis komponen karbohidrat menjadi glukosa yang dibutuhkan selama produksi metabolit sekunder. Penelitian untuk meningkatkan produksi lovastatin melalui ko-kultur juga sudah dilakukan oleh Panda 2010. Upaya yang ditempuh dengan melakukan ko- kultur M. purpureus dan M. ruber melalui optimasi parameter-parameter fermentasi meliputi temperature, waktu fermentasi, volume inokulum dan pH pada substrat fermentasi padat, dilakukan dengan menggunakan metodologi respon permukaan dari desain factorial Box-Behnken . Produksi lovastatin maksimum adalah 2,83 mgg setara dengan 0,28 pada hari ke 14 dibawah kondisi proses yang dioptimasi. Penelitian ini bertujuan meningkatkan produksi lovastatin angkak oleh enam strain M. purpureus yang ditumbuhkan bersama ko-kultur dengan khamir amilolitik indigenus. Dari penelitian ini akan diperoleh informasi strain, konsentrasi dan waktu ko-kultur yang optimal dalam produksi lovastatin. BAHAN DAN METODE PENELITIAN Strain Kapang dan Khamir Kapang yang digunakan pada penelitian ini adalah enam strain Monascus purpureus yakni TOS, JmbA, AID, JmbA3M, JmbA5K dan AS3K koleksi laboratorium Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biolog, LIPI, Cibinong, Bogor. Khamir yang digunakan adalah E. burtonii penghasil amilase hasil seleksi dari 16 strain khamir, lima strain koleksi laboratorium Ilmu Hayati, ITB, Bandung, dan 11 strain koleksi laboratorium Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biolog, LIPI, Cibinong. Peremajaan M. purpureus TOS, JmbA5K, AID, JmbA3M, JmbA dan AS3K dilakukan pada agar miring MEA Malt Ekstrak Agar. Agar miring yang telah digores diinkubasi pada suhu 30°C selama 7 hari. Pada hari ke 7 jumlah spora 66 mencapai 2.25 x 10 7 cfuml. Biakan agar miring tersebut kemudian disimpan dalam lemari pendingin sebagai kultur stok. Strain khamir diremajakan pada media agar miring Yeast Malt Agar YM agar, dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 2 hari. Biakan khamir yang telah tumbuh disimpan dalam lemari pendingin sebagai kultur stok. Substrat fermentasi Substrat yang digunakan untuk fermentasi angkak adalah beras IR 42, diperoleh dari pasar di daerah Bogor, Jawa Barat. Beras IR 42 sebagai substrat padat pada fermentasi angkak, dicuci dan direndam ±1 malam, kemudian ditiriskan dan disterilisasi 121ºC selama 30 menit. Beras didinginkan dan siap digunakan sebagai sustrat fermentasi M. purpureus pada produksi angkak. Persiapan Starter Monascus purpureus Tahap awal persiapan starter M. purpureus adalah pembuatan suspensi M. purpureus dari 6 strain yang digunakan yaitu TOS, JMBA 5K, AID dan JMBA 3M, JmbA dan AS3K. Akuades steril sebanyak 2,5 mL dimasukkan ke dalam masing- masing biakan agar miring M. purpureus yang berumur 14 hari, kemudian dilakukan penggoresan sampai biakan terlepas sehingga diperoleh suspensi biakan M. purpureus . Untuk membuat starter, sebanyak 25 g beras dalam cawan petri disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Setelah disterilisasi, beras didinginkan sampai suhu  36 C. Beras kemudian diinokulasi dengan suspensi M. purpureus sebanyak 2,5 mL dan diaduk merata menggunakan pengaduk steril. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 27-32 C selama 14 hari. Setelah berumur 14 hari, siap digunakan sebagai starter untuk produksi angkak. Setiap 2,5 g starter  10 dapat digunakan atau ditambahkan pada 25 g beras yang sudah disterilisasi untuk produksi angkak . 67 Produksi lovastatin oleh M. purpureus kultur tunggal dan ko-kultur dengan Endomycopsis burtonii Produksi angkak menggunakan enam strain M. purpureus sebanyak 10 7 cfuml menggunakan substrat beras IR 42 yang telah disterilisasi dahulu. Ko- kultur dilakukan dengan menambahkan E. burtonii pada hari fermentasi ke 2, 4, dan 6 dengan variasi konsentrasi 10 3 , 10 4 , dan 10 5 cfuml. Fermentasi angkak menggunakan kultur tunggal sekaligus berfungsi sebagai kontrol, dilakukan hanya menggunakan M. purpureus tanpa E. burtonii. Fermentasi dilakukan pada suhu ± 30°C selama 14 hari. Setelah 14 hari, dilakukan pemanenan dengan cara dikeluarkan dari rak fermentasi , kemudian ditempatkan pada wadah tahan panas, selanjutnya angkak dikeringkan pada suhu 60°C selama ±12 jam sampai mencapai kadar air ± 5. Analisis Kadar Lovastatin Miyake et al, 1984 Ekstraksi sampel Angkak hasil ko-kultur M. purpureus dengan E. burtonii maupun hasil fermentasi tunggal setelah 14 hari fermentasi, dihancurkan menjadi bentuk bubuk 80 mesh, selanjutnya ditimbang 1 g kemudian diekstrak dengan 2 ml asetonitril dan 0,1 ml asam fosfat 0,1, diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Sampel disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan kemudian disaring dengan kertas saring membran nilon berukuran 0,45 mikron. Sampel kemudian diinjeksikan ke HPLC dengan menggunakan fase gerak seperti pada larutan standard lovastatin. Preparasi larutan standar Lovastatin Standar lovastatin dipersiapkan pada beberapa konsentrasi, yaitu 0,1, 1 dan seterusnya. Asetonitril sebanyak 2 ml dan 0,1 ml asam fosfat 0,1 ditambahkan. Disaring dengan kertas saring membran nilon berukuran 0,45 mikron. Larutan kemudian diinjeksikan ke HPLC. Fase mobil dikomposisikan dengan perbandingan 68 asetonitril : asam fosfat 0,1 pada rasio 65:35 perbandingan per volume . Laju aliran diatur pada kecepatan 1.0 mLmenit; T=28 o C menggunakan kolom Nukleosil 100-5 C 18 . Kadar lovastatin dihitung sebagai berikut : Luas area sampel x Konsentrasi standar Luas area standar Analisis Kadar Sitrinin Miyake et al 1984 Angkak hasil ko-kultur M. purpureus dengan E. burtonii maupun hasil fermentasi tunggal setelah 14 hari fermentasi, dihancurkan menjadi bentuk bubuk 80 mesh, selanjutnya ditimbang 0,5 g. Angkak diekstrak dengan 50 ml etanol 70 dan diaduk menggunakan stirer magnetik selama 3 jam, kemudian disaring dengan kertas saring 0,20-µm filter DISMIC-13 cp;Advantec, Tokyo, Japan. Kondisi HPLC menggunakan kolom: NUCLEOSIL 100-5 C-18, dan detektor fluoresen λ ex = 331, λ em=500. Sampel dielusi dengan fase gerak : Asetonitril: akuades: TFA 1000:1000:1. Laju aliran adalah 0,8 mLmenit; T=40°C. Analisis Data Analisis data yang digunakan untuk melihat signifikansi perbedaan kadar lovastatin akibat perlakuan ko-kultur M. purpureus dangan E. burtonii adalah dengan uji ANOVA dan bila terdapat signifikansi, diuji lanjut dengan uji Duncan dengan tingkat kepercayaan 95. 69 HASIL DAN PEMBAHASAN Produksi lovastatin oleh enam strain M. purpureus Kadar lovastatin angkak yang diproduksi menggunakan strain M. purpureus TOS, JmbA5K, AID, JmbA 3M, JmbA dan AS3K disajikan pada Gambar 5.3. Strain JmbA, TOS dan AID merupakan hasil isolasi dari sampel angkak yang terdapat di beberapa daerah masing-masing dari daerah Jember, Pontianak dan medan. Tiga strain lain yaitu JmbA3M, JmbA5K dan AS3K merupakan hasil mutasi menggunakan sinar UV. Gambar 5.1 Kadar lovastatin angkak yang diproduksi oleh enam strain Monascus purpureus setelah 14 hari fermentasi Gambar 5.1 menunjukkan bahwa strain-strain tersebut memiliki kemampuan yang berbeda dalam memproduksi lovastatin. Strain JmbA3M kadar 0,8 0,37 0,17 1,42 1,27 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 TOS JmbA AID JmbA3M AS3K JmbA5K Kadar lovastatin Strain Monascus purpureus TOS JmbA AID JmbA3M AS3K JmbA5K 70 lovastatin 1,42 dan strain AS3K kadar lovastatin 1,27 secara statistik tidak berbeda nyata α 5 dalam hal kemampuan memproduksi lovastatin. Kedua strain hasil mutasi tersebut memiliki kemampuan yang lebih tinggi dan berbeda nyata dibanding strain lainnya. Kadar lovastatin yang diproduksi oleh strain TOS, JmbA, AID dan JmbA5K berturut turut adalah: 0,8, 0,37, 0,17, dan 0,1. Perbedaan kemampuan strain-strain M. purpureus tersebut dalam memproduksi lovastatin, kemungkinan disebabkan oleh keragaman faktor genetis dari masing-masing strain. Pengaruh ko-kultur M. purpureus dengan E. burtonii terhadap produksi lovastatin Kadar lovastatin angkak hasil ko-kultur terhadap enam strain M. purpureus dengan E. burtonii disajikan pada Gambar 5.2. Keenam strain M. purpureus menunjukkan respon yang bervariasi terhadap penambahan E. burtonii dengan jumlah dan waktu yang divariasikan . Ko-kultur M. purpureus dengan E. burtonii memberikan pengaruh nyata terhadap produksi lovastatin oleh semua strain M . purpureus yang diteliti. Uji statistik p0,05 menunjukkan bahwa pengaruh penambahan E. burtonii dengan variasi konsentrasi 10 3 cfuml, 10 4 cfuml dan 10 5 cfuml menyebabkan peningkatan produksi lovastatin pada beberapa strain. Strain JmbA5K dan AID, penambahan E. burtonii pada konsentrasi 10 3 cfuml, 10 4 cfuml dan 10 5 cfuml, menyebabkan peningkatan produksi lovastatin secara nyata dibanding kontrol. Gambar 5.2 Pengaruh waktu penambahan dan konsentrasi E. burtonii cfuml terhadap produksi lovastatin angkak oleh M. purpureus 771 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 K ad ar l ova st at in Hari penambahan E. burtonii Kontrol 103 cfuml 104cfuml 105 cfuml TOS 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 K ad ar l ova st at in Hari penambahan E. burtonii Kontrol 103 cfuml 104cfuml 105 cfuml JMBA5K 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 K ad ar l ova st at in Hari penamabahan E. burtonii Kontrol 103 cfuml 104cfuml 105 cfuml AID 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 K ad ar l ova st at in Hari penambahan E. burtonii Kontrol 103 cfuml 104cfuml 105 cfuml JMBA3M 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 K adar lo v as tat in Hari penambahan E. burtonii Kontrol 103 cfuml 104cfuml 105 cfuml JMBA 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 K ad ar l ova st at in Hari penambahan E. burtonii Kontrol 103 cfuml 104cfuml 105 cfuml AS3K Kontrol 10 3 cfuml 10 4 cfuml 10 5 cfuml Kontrol 10 3 cfuml 10 4 cfuml 10 5 cfuml Kontrol 10 3 cfuml 10 4 cfuml 10 5 cfuml Kontrol 10 3 cfuml 10 4 cfuml 10 5 cfuml Kontrol 10 3 cfuml 10 4 cfuml 10 5 cfuml Kontrol 10 3 cfuml 10 4 cfuml 10 5 cfuml 72 Terdapat interaksi yang nyata antara pengaruh konsentrasi dan waktu penambahan E. burtonii terhadap produksi lovastatin angkak. Konsentrasi dan waktu penambahan E. burtonii tertentu menyebabkan peningkatan produksi lovastatin. Penambahan E. burtonii pada 10 3 cfuml pada hari ke 4 dan konsentrasi 10 4 cfuml pada hari ke 6 menyebabkan peningkatan produksi lovastatin yang nyata terhadap strain TOS. Untuk strain JmbA penambahan E. burtonii pada 10 3 cfuml pada hari ke 4 menyebabkan peningkatan kadar lovastatin secara nyata. Pada strain AID, penambahan E. burtonii hari ke 2 dengan konsentrasi 10 4 dan 10 5 cfuml, hari ke 4 dan ke 6 pada semua konsentrasi menyebabkan peningkatan produksi lovastatin yang nyata. Kadar lovastatin tertinggi dihasilkan oleh strainTOS pada penambahan E. burtonii pada hari ke 6 dengan konsentrasi 10 4 cfuml yaitu sebesar 2,2. Pengaruh ko-kultur E. burtonii pada produksi angkak oleh strain-strain M. purpureus mutan menunjukkan, bahwa hanya strain JmbA5K yang kadar lovastatinnya meningkat pada semua waktu dan konsentrasi penambahan E. burtonii. Strain-strain lainnya yaitu JmbA3M dan AS3K menunjukkan penurunan produksi lovastatin pada semua waktu dan konsentrasi penambahan E. burtonii. Peningkatan kadar lovastatin angkak setelah perlakuan ko-kultur M. purpureus dengan E. burtonii kemungkinan disebabkan oleh pengaruh enzim amilase yang dihasilkan oleh E. burtonii. Amilase akan mendegradasi substrat menjadi komponen-komponen yang lebih sederhana seperti glukosa. Senyawa- senyawa sederhana yang terbentuk lebih mudah dikonsumsi M. purpureus untuk kebutuhan pertumbuhannya. Sebaliknya E. burtonii juga membutuhkan substrat untuk pertumbuhan. Kebutuhan akan subtrat untuk pertumbuhan, memungkinkan terjadinya kompetisi antara M. purpureus dan E. burtonii. Kondisi kompetisi memicu kapang M. purpureus memproduksi metabolit-metabolit sekunder untuk mempertahankan diri. Fenomena lain kemungkinan juga dapat terjadi seperti yang dilaporkan Danuri 2008, bahwa semua strain M. purpureus mempunyai kemampuan memproduksi enzim amilase. Jumlah amilase yang semakin banyak, baik amilase yang dihasilkan oleh M. purpureus maupun oleh E. burtonii, menyebabkan semakin 73 banyak pula amilosa dalam substrat yang dihidrolisis menjadi glukosa. Glukosa dibutuhkan sebagai sumber energi selama pengembangan produksi metabolit sekunder. Dengan demikian semakin banyak pula lovastatin yang diproduksi selama fermentasi angkak ko-kultur M. purpureus dengan E. burtonii Danuri, 2008. Kemungkinan lain yakni fenomena mekanisme pertahanan diri M. purpureus terhadap lingkungannya juga dapat mempengaruhi M. purpureus untuk meningkatkan produksi lovastatin. Shin et al., 2005 melaporkan, bahwa jenis khamir tertentu menghasilkan enzim-enzim hidrolitik seperti amilase dan kitinase. Selama ko-kultur enzim-enzim hidrolitik yang diproduksi khamir dapat menyerang dinding sel kapang. Serangan enzim ini dapat menyebabkan dinding sel kapang terdegradasi. Kondisi ini memicu kapang M. purpureus untuk melakukan pertahanan diri dengan mengeluarkan atau memproduksi komponen-komponen hidrofobik berupa metabolit sekunder seperti pigmen dan lovastatin. Rendahnya produksi lovastatin strain JmbA5K dan AS3K sebagai strain mutan setelah ko-kultur dibanding sebelum di ko-kultur, kemungkinan disebabkan oleh ketidakmampuan strain-strain tersebut untuk memproduksi lovastatin yang tinggi akibat terganggu oleh kehadiran E. burtonii. Strain JmbA5K dan AS3K merupakan strain hasil perlakuan mutasi menggunakan sinar UV. Kondisi strain JmbA5K dan AS3K sebagai strain mutan, menyebabkan strain-strain tersebut sensitif. Dengan kehadiran E. burtonii yang ditumbuhkan bersama, kemungkinan dapat mengganggu pertumbuhan strain-strain tersebut dan menyebabkan ketidakmampuan memproduksi lovastatin tinggi. Peningkatan kadar lovastatin angkak oleh pengaruh ko-kultur menggunakan E. burtonii menunjukkan peningkatan yang signifikan dibandingkan penelitian- penelitian yang dilakukan sebelumnya. Kadar lovastatin strain TOS H 6 10 4 yakni sebesar 2,19 menunjukkan peningkatan signifikan dibanding TOS kontrol 0,8. Penelitian oleh Danuri 2008 yang melakukan optimasi produksi pigmen dan lovastatin angkak oleh M. purpureus, melaporkan bahwa konsentrasi lovastatin angkak tertinggi, diperoleh pada perlakuan penambahan Tween 80. Rata-rata kandungan lovastatin 5 ulangan 254,9±9.7 ppm 0,025 atau meningkat 40,78 74 dibanding kontrol. Sedangkan Panda et al., 2010 melakukan optimasi parameter- parameter fermentasi untuk meningkatkan produksi lovastatin angkak melalui ko- kultur M. purpureus MTCC 369 dan Monascus ruber MTCC 1880. Fermentasi dilakukan menggunakan beras lokal india sebagai substrat padat. Optimasi dilakukan pada parameter-parameter proses fermentasi seperti suhu, waktu fermentasi, volume inokulum, dan pH medium, dengan metodologi respon permukaan dari desain faktorial Box-Behnken. Produksi lovastatin tertinggi diperoleh sebesar 2,83 mgg 0,28. Pada pelitian Astuti 2004 yang mempelajari pengaruh penambahan Tween 80 ke dalam substrat beras putih dan beras merah menghasilkan kadar lovastatin pada beras putih 0,16, dan pada beras merah 0,26. Walaupun kadar lovastatin hasil-hasil penelitian tersebut menunjukkan peningkatan dibanding kontrol, tetapi masih jauh lebih rendah dibandingkan kadar lovastatin angkak hasil ko-kultur M. purpureus dengan E.burtonii. Penurunan produksi lovastatin angkak oleh strain TOS akibat penambahan E. burtonii pada awal fermentasi dengan konsentrasi 10 3 cfuml kemungkinan disebabkan hal-hal berikut. Kondisi awal fermentasi merupakan fase kritis pertumbuhan mikroba. Pada tahap awal mikroba membutuhkan fase adaptasi terhadap lingkungan pertumbuhannya. Penambahan khamir pada tahap awal fermentasi dapat mengganggu pertumbuhan M. purpureus. Lim et al., 2000 melaporkan bahwa kehadiran khamir pada awal pertumbuhan dapat menjadi kompetitor bagi kapang. Masalah utama pada teknik ko-kultur, produksi pigmen dan lovastatin dapat menurun disebabkan khamir S. cerevisiae dapat menekan pertumbuhan M. purpureus ketika penambahan S. cereviseae. terlalu awal dan dalam jumlah yang terlalu tinggi Lim et al 2000 . Pengaruh ko-kultur M. purpureus dengan E. burtonii terhadap produksi sitrinin Sitrinin merupakan mikotoksin yang diproduksi M. purpureus. Produksi sitrinin oleh M. purpureus strain TOS, AID dan JmbA sebelum dan setelah ko-kultur AIDdengan E. burtonii disajikan pada Gambar 5.3. G G d d p m o d M M p t T s k Gambar 5.3. Grafik pada dengan E. dibanding t purpureus menyebabka oleh M. pur dibawah nila Morehouse Apl Monascus p produksi lov tingkat prod TOS. Produ sekitar 3 kal ke 6 ferment

0, 1,