81
A
260
=nilai absorban RNA pada panjang gelombang 260nm, 40µgml= nilai faktor konversi 1 unit absorban pada 260 nm sebanding dengan 40µg RNA per ml,
fp=faktor pengenceran Wilson dan Walker 2000.
c. Elektroforesis gel agarosa
Komposisi gel agarosa 1 : agarose 1 gram, TAE 1X Tris-acetate-EDTA ditambahkan sampai volume 100 ml, Etidium Bromida EtBr 5 µl. Elektroforesis
Running gel dilakukan dengan tegangan 90 Volt selama 1 jam. Setelah selesai, gel divisualisasi pada lampu ultraviolet UV dan difoto dengan kamera Polaroid.
d. PCR dan RTPCR Polymerase Chain Reaction and Reverse Transcriptase-
PCR
Reaksi RT PCR terdiri atas dua tahap, yaitu sintesis cDNA complementary DNA
dan PCR dalam satu tabung dengan menggunakan primer spesifik gen yang diinginkan. Primer yang digunakan dalam reaksi adalah sebagai berikut:
Primer lov B R : 5’-CTTGCCCTAAACGGGAGAGT-3’R : antisense primer Primer lov B F : 5’-AGGGAGCCATGTTGGACTT-3’ F : sense primer
Primer lov B merupakan primer spesifik gen yang dapat meningkatkan sensitivitas
dengan mengarahkan seluruh aktifitas enzim RT untuk mentranskripsi balik hanya RNA tertentu saja.
Program RT-PCR dilakukan pada suhu 50°C selama 30 menit untuk sintesis
cDNA. Pengaturan suhu dan siklus PCR dilakukan dengan kondisi sebagai berikut:
Satu siklus pre denaturasi 96 °C, 4 menit, satu siklus denaturasi 96 °C, 30 detik, 40 siklus penempelan annealing 55°C, 30 detik, 1 siklus pemanjangan elongasi
72 °C, 2 menit, dan 1 siklus pemanjangan tambahan 72°C ,7 menit. e. Pengukuran intensitas ekspresi gen penghasil lovastatin dengan
CS Analyzer
Foto hasil elektroforesis gel agarosa diinput ke dalam komputer, kemudian dilakukan penghitungan intensitas ekspresi gen lovastatin gen lov B menggunakan
program CS Analyzer.
82
Hasil dan Pembahasan
Ekspresi Gen Yang Bertanggung Jawab pada Biosintesis Lovastatin
Analisis ekspresi gen yang bertanggung jawab pada biosintesis lovastatin difokuskan pada gen lovB, karena gen lovB diketahui bertanggung jawab terhadap
enzim lovastatin nonketida sintase LNKS yang menentukan tahap akhir perubahan ketida menjadi lovastatin. Analisis ekspresi gen lovB dilakukan dengan mengisolasi
fragmen pembawa pesan yang terkandung di dalam gen lov B yakni mRNA untuk dianalisis kemurnian, konsentrasi serta dilakukan amplifikasi RT-PCR untuk
dipelajari intensitas ekspresi gennya. Mengingat isolasi mRNA sangat sulit dan sensitif, maka isolasi dilakukan terhadap total RNA. Total RNA mengandung
fragmen-fragmen tRNA RNA transfer, rRNA RNA ribosom, dan mRNA
messenger RNA. Hasil uji tingkat kemurnian RNA yang diisolasi dari strain M. purpureus
JmbA H410
3
, AID H210
3
, TOS H610
4
yang menghasilkan kadar lovastatin tinggi setelah ko-kultur dengan E. burtonii, dari strain M. purpureus kontrol JmbA, AID,
dan TOS dapat dilihat pada Tabel 6.1.
Tabel 6.1 Tingkat kemurnian total RNA A
260nm
A
280nm
dari strain M. purpureus
yang diisolasi dari angkak hasil fermentasi ko-kultur dengan E
. burtonii
Sampel
Absorbansi
Rasio A260nm A280nm
A 260nm280nm
TOS kontrol TOS H610
4
JmbA kontrol JmbA H410
3
AID kontrol AID H210
4
0,137 0,465
0,167 0,133
0,242 0,255
0,075 0,246
0,091 0,064
0,135 0,149
1,9 2,1
2,1 2,1
2,1 2,1
83
Pada Tabel 6.1 isolasi RNA dilakukan menggunakan kapang yang masih muda 3-4 hari, dimana fase pertumbuhan kapang berada pada fase logaritmik
seperti yang telah diamati sebelumnya pada pengamatan kurva pertumbuhan strain-
strain M. purpureus Gambar 14. Pada fase pertumbuhan logaritmik, umumnya
ditemukan asam nukleat terutama RNA dalam jumlah yang cukup banyak. Umur kapang yang sudah tua 7-10 hari, tidak cocok untuk tujuan isolasi RNA, karena
sudah terjadi pigmentasi yang mengakibatkan berkurangnya kandungan asam nukleat Handayani 2006.
Total RNA yang diperoleh dari semua strain yang dianalisis mempunyai rasio A
260nm
A
280nm
sebesar 2,1 kecuali strain TOS kontrol yang mempunyai nilai sebesar 1,9 Tabel 6.1. Total RNA hasil isolasi tersebut merupakan RNA yang
sudah murni dan tidak terkontaminasi oleh fragmen protein maupun DNA. Sambrook et al. 1989 menyatakan bahwa RNA yang murni mempunyai rasio
serapan pada absorbansi 260280 lebih dari 1,8. Kemurnian total RNA diperlukan berkaitan dengan analisis konsentrasi,
.amplifikasi dan intensitas ekspresi gen diharapkan benar-benar menggambarkan ekspresi dari gen yang bertanggung jawab pada produksi lovastatin bukan dari
komponen-komponen lain.yang tidak bertanggung jawab pada produksi lovastatin .
Hasil pengukuran konsentrasi total RNA yang diisolasi dari strain M. purpureus
ko-kultur dengan E. burtonii disertai kontrol disajikan pada Tabel 6.2. Semua isolat yang diisolasi dari angkak setelah fermentasi ko-kultur dengan E.
burtonii , menunjukkan konsentrasi yang lebih tinggi dari kontrolnya, dan tertinggi
ditunjukkan oleh isolat TOS H610
4
. Konsentrasi total RNA strain TOS
H610
4
yaitu strain TOS hasil ko-kultur dengan penambahan E. burtonii pada penambahan hari ke 6 dengan konsentrasi 10
4
menunjukkan konsentrasi RNA tiga kali lipat lebih tinggi dibandingkan kontrol. Konsentrasi yang ditunjukkan oleh TOS
H610
4
ini sesuai dengan kadar lovastatin yang diproduksi oleh strain TOS
H610
4
2,19 sebagai pengaruh dari ko-kultur dengan E. burtonii yang mengalami peningkatan dibanding kontrol 0,8.
Demikian juga untuk strain AID H210
4
dan
JMBA H410
3
memiliki konsentrasi total
84
RNA sekitar dua kali lebih tinggi dibanding kontrol. Konsentrasi total RNA dengan produksi lovastatin yang tinggi pada strain TOS
H610
4
kemungkinan berkaitan dengan hal-hal berikut. Total RNA didalamnya terkandung fragmen mRNA atau
messenger RNA yang berfungsi sebagai pembawa pesan atau informasi dalam sebuah gen untuk disampaikan kepada mesin pembuat protein atau enzim. Tiap-tiap mRNA
dipergunakan sebagai cetakan untuk membentuk molekul yang sesuai. Dengan semakin banyak jumlah mRNA ditunjukkan dengan konsentrasi total RNA yang
tinggi, maka akan semakin banyak pula molekul yang sesuai yang akan diproduksi Murray et al, 2003.
Tabel 6.2 Pengaruh ko-kultur M. purpureus dengan E. burtonii terhadap konsentrasi total RNA
Sampel Konsentrasi total RNA µgml
TOS kontrol TOS H610
4
JMBA kontrol JMBA H410
3
AID kontrol AID H210
4
668 1860
548 968
532 1020
Konsentrasi total RNA pada Tabel 6.2 memperkuat hasil elektroforesis RNA yang diisolasi dari strain M. purpureus Gambar 6.1. Konsentrasi total RNA tertinggi
oleh strain TOS H610
4
, dan pada Gambar 6.1 strain tersebut juga menunjukkan pita yang paling tebal. Soedarmadji 1996 melaporkan bahwa tebal tipisnya pita yang
terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama.
85
Gambar 6.1 Hasil isolasi total RNA strain M. purpureus ko-kultur dengan E. burtonii
MK : marker Sharp DNA Ladder Marker, 1: JmbA, 2: JmbA H410
3
, 3: AID, 4: AID H210
3
, 5: TOS H610
4
, 6:
TOS Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul
bermuatan dapat bergerak bebas dibawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau
berdekatan.
Visualisasi hasil isolasi total RNA strain-strain M. purpureus JmbA, JmbA
H410
3
, AID, AID H210
3
, TOS H610
4
, dan sampel TOS
,
pada gel agarosa, memperlihatkan pita-pita yang cukup jelas
.
Pita
-
pita yang terbentuk merupakan hasil pergerakan migrasi RNA dari kutub negatif ke kutub positif pada gel agarosa yang
disebabkan oleh adanya efek elektroendosmosis. Proses ini disebabkan karena terjadinya ionisasi kelompok asam biasanya sulfat yang menempel pada matriks
polisakarida dari gel agarosa. Elektroforesis hasil amplifikasi cDNA pada gel agarosa disajikan pada
Gambar 6.2. Primer yang digunakan dalam reaksi PCR dan RT-PCR Polymerase Chain Reaction and Reverse Transcriptase- PCR
adalah primer lov B. Sampel satu
sampai dengan enam menunjukkan ekspresi gen lov B yakni gen penghasil lovastatin pada M. purpureus strain JmbA 1, JmbA H410
3
2, AID 3, AID H210
3
4, TOS5, TOS H610
4
6. Ekspresi gen lov B yang ditunjukkan berukuran 200 pb pasang basa.
Mk 1 2 3 4 5 6
86
Gambar 6.2 Pola ekspresi gen lov B pada M. purpureus hasil ko-kultur menggunakan E. burtonii. Mk: marker Sharp DNA Ladder
Marker , 100 bp, CRBC, 1: JmbA k, 2: JmbA H410
3
, 3: AID k, 4: AID H210
3
, 5: TOSk, 6: TOS H610
4
Untuk mengetahui intensitas ekspresi gen lov B strain M. purpureus ko- kultur dengan khamir E. burtonii, dilakukan analisis menggunakan CS analyser
terhadap produk hasil RT-PCR. Data intensitas ekspresi gen tersebut disajikan pada Tabel 6.3 dan elektrogram analisis pita pada elektroforesis hasil amplifikasi cDNA
pada gel agarosa disajikan pada Gambar 6.3.
Tabel 6.3 Intensitas ekspresi gen lov B strain M. purpureus ko-kultur dengan E. burtonii
PEAK NO INTENSITAS
KADAR LOVASTATIN
Lane No. 1 JmbA k
3537 0,37
Lane No. 2 JmbA H410
3
5994 0,98
Lane No. 3 AID k 5940
0,17
Lane No. 4 AID H210
3
9531 1,17
Lane No. 5 TOS H610
4
11691 2,19
Lane No. 6 TOS k 8910
0,8
Intensitas ekspresi gen penghasil lovastatin tertinggi dihasilkan sampel TOS H610
4
: 11691 kemudian diikuti sampel AID H210
3
: 9531, TOS k: 8910, JmbA
300 200
100 Mk
1 2 3 4 5 6 6
bp
87
H410
3
: 5994, AID k: 5940 , dan JmbA k: 3537. Sifat fenotipik M. purpureus
TOS H610
4
hasil ko-kultur menggunakan E. burtonii berkaitan produksi lovastatin tinggi, sejalan dengan sifat genotipik ditunjukkan dengan tingginya intensitas
ekspresi gen penghasil lovastatin. Intensitas ekspresi gen penghasil lovastatin yang tinggi pada sampel TOS
H610
4
hasil ko-kultur berkaitan erat dengan peran amilase yang dihasilkan oleh E. burtonii
. Amilase akan memecah substrat karbohidrat menjadi unit-unit glukosa. Glukosa merupakan sumber karbon dan dapat mendorong komplek regulasi pada
ekspresi gen dan aktivitas enzim untuk mensitesa poliketida Hajjay et al, 2001. Semakin banyak glukosa yang terbentuk, dorongan terhadap komplek regulasi pada
ekspresi gen dan aktivitas enzim untuk mensitesa poliketika lovastatin akan semakin banyak pula, sehingga lovastatin yang disintesapun akan semakin banyak.
Glukosa yang terbentuk dari aktivitas amilase, berperan sebagai signal bagi DNA untuk mentransfer informasi genetik kepada RNA transkripsi yang merupakan tahap
awal proses ekspresi gen. Proses transkripsi merupakan proses pembentukan rantai poliribonukleotida dari berbagai monoribonukleotida dengan melibatkan ruas DNA
sebagai model cetakannya dan dipandu oleh enzim transkriptase sebagai katalisator. Transkriptase adalah polimerase RNA yang khusus berperanan dalam proses
transkripsi. Runtunan basa pada utasan RNA ditentukan oleh runtunan basa yang terdapat pada suatu utas DNA model cetakan. Polemerase RNA akan membaca basa-
basa yang terdapat pada ruas DNA, dan untuk setiap basa tersebut akan dicari padanan ribonukleotida yang kemudian akan dirangkaikan menjadi rantai RNA.
Tahap selanjutnya adalah proses translasi yaitu penterjemahan informasi genetik yang terdapat pada RNA ke dalam polipeptida yang dapat berupa ensim lovastatin
nonketida sintase LNKS yang menentukan tahap akhir perubahan ketida menjadi lovastatin.
88
Gambar 6.3 Elektrogram analisis pita pada elektroforesis hasil amplifikasi cDNA pada gel agarosa strain-strain M. purpureus ko-kultur
dengan E. burtonii
89
SIMPULAN
Ko-kultur strain M. purpureus dengan E. burtonii untuk tujuan meningkatkan kadar lovastatin, mempengaruhi ekspresi gen penghasil lovastatin gen
lov B. Isolasi terhadap total RNA strain-strain M. purpureus hasil ko-kultur dengan E. burtonii
menghasilkan tingkat kemurnian yang baik ditunjukkan rasio absorbansi A
260nm
A
280nm
lebih dari 1,8. Total RNA tertinggi diperoleh dari gen M. purpureus strain TOS H6104 dengan konsentrasi tiga kali lipat lebih tinggi dibanding kontrol.
Espresi gen lov B tertinggi juga dihasilkan gen M. purpureus strain TOS H610
4
: 11691 kemudian diikuti strain-strain AID H210
3
: 9531, TOS k: 8910, JmbA H410
3
: 5994,
AID k : 5940 , dan JmbA k: 3537. Dari hasil yang diperoleh dapat
disimpulkan bahwa sifat fenotipik M. purpureus TOS H610
4
hasil ko-kultur menggunakan E. burtonii untuk produksi lovastatin tinggi, sejalan dengan sifat
genotipiknya yang ditunjukkan dengan tingginya intensitas ekspresi gen penghasil lovastatin.
DAFTAR PUSTAKA
Astuti, S. 2004
. Seleksi isolat Monascus purpureus penghasil lovastatin dan analisis kadarnya, Program Studi Biokimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam FMIPA, IPB, Bogor
Alberts AW, J Chen, G Kuron, V Hunt, J Huff, C Hoffman. 1980. Mevinolin : A.
highly potent competitive inhibitor of hydroxymethyl glutaryl coenzyme A reductase and cholesterol lowering agent. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America , 777, 3957-3961.
Banerjee R, G Mukherjee, and KC Patra. 2005.
Microbial transformation of tannin-rich substrate to gallic acid through co-culture method. Bioresource
Technology , 968, 949-953.
90
Chiu CH, NiKH Guu, YK TM Pan. 2006 . Production of red mold rice using a
modified Nagata type Koji marker. Applied Microbiology and Biotechnology, 732
, 297-304. Chomenzynski P. and N Sacchi. 1987.
Single step methods of RNA isolation by
acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 162:
156-159. Danuri H. 2008.
Optimizing angkak pigment and lovastatin production by Monascus purpureus. Hayati Journal of Bioscience, June,
p 61-66. Hames BD., NM. Hooper . 2000.
Biochemistry Instant Notes. School of
biochemistry and molecular biology, university of leeds, UK. Handayani WR. 2006
. Penurunan ekspresi gen pho85 sel apoptosis Saccharomyces cerevisiae
oleh ekstrak air daun ciplukan 33NHR dan Geobacillus sp. 22a.
Bogor. Hajjaj H, P Niedberger, P Duboc. 2001.
Lovastatin biosynthesis by Aspergillus terreus
in chemically defined medium. Applied and Environmental Microbiology, 676,
2596-2604. Kohama Y, S Matsumoto, T Mimura, N Tanabe, A Inada, T Nakanishi, T.
1987. Isolation and identification of hypotensive principles in red-mold rice.
