35
3. METODOLOGI UMUM
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong, dan Laboratorium Pengujian, VEDCA, Cianjur. Penelitian berlangsung
dari bulan Desember 2007 sampai dengan April 2009.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan sebagai substrat fermentasi Monascus purpureus adalah beras jenis IR 42 yang diperoleh di sekitar pasar Bogor, Jawa Barat.
Kultur mikroba untuk produksi angkak menggunakan enam strain M. purpureus koleksi laboratorium Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, LIPI,
Cibinong, Bogor yang terdiri dari TOS, AID, JmbA, JmbA5K, JmbA3M, dan dan AS3K. Khamir indigenus yang digunakan adalah 16 strain yaitu lima strain
koleksi Lab. Ilmu Hayati ITB : Saccharomyces cerevisiae, Pichia, Schizosaccharomyces, Endomycopsis burtonii,
Candida utilis dan 11 strain koleksi laboratorium Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, LIPI,
Cibinong, Bogor: S. cerevisiae Mka, Mkb, Unb, Mk, Imb, Gl, D5a, Mgb, Hm, Dmga,
dan Kd. Bahan-bahan kimia yang digunakan meliputi etanol 70, media Malt
Ekstrak Agar MEA, bacto agar, pati 2, NaCl 5grl, NaOH 1M, HCL 1M,
buffer Tris HCl 20 mM pH 7,0 , akuades, metanol, standar lovastatin, standar sitrinin. 0,1 moll NaOH, asetonitril, H
3
PO
4
, etil asetat, bahan-bahan kimia untuk isolasi m. RNA meliputi : TRIzol, kloroform, isopropil alkohol, etanol 75
perlakuan DEPC-treated water
RNase free water water add
diethylpyrocarbonate DEPC, Stock buffer 200 mM NaCl ; 200 mM Tris-Cl pH 7,5 ; 1,5 mM MgCl ; 2 SDS, buffer TAE, gel agarosa.
Alat-alat yang digunakan meliputi autoklaf, High Pressure Liquid Chromatography
HPLC, laminar air flow, perangkat gel elektroforesis, inkubator shaker, inkubator, pipet mikro, bunsen, ose, oven, neraca analitik, pH
meter, vorteks, spektrofotometer, perangkat program densitometer CS analyzer sentrifuse, tabung eppendorf, , alat-
alat gelas, serta alat-alat lainnya.
36
Metode Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dalam 4 tahap seperti terlihat pada Gambar 3.1, meliputi:
1. Seleksi 16 isolat khamir indigenus untuk mendapatkan khamir amilolitik dan pengamatan kurva pertumbuhan enam strain M. purpureus
2. Produksi angkak oleh M. purpureus ko-kultur dengan khamir indigenus terpilih khamir amilolitik. Angkak yang dihasilkan kemudian dilakukan
analisis intensitas warna, kadar lovastatin dan kadar sitrinin. 3. Analisis intensitas ekspresi gen yang bertanggung jawab pada biosintesis
lovastatin dari M. purpureus penghasil lovastatin tertinggi setelah di ko-kultur dengan khamir amilolitik. Tahap ini dilakukan dengan melalui serangkaian
analisis meliputi : isolasi total RNA, transkripsi balik menggunakan PCR Reverse-Transcription
Polymerase Chain Reaction, elektroforesis, dan pengukuran densitas.
4. Mempelajari stabilitas pigmen dan lovastatin angkak oleh pengaruh suhu dan pH.
Seleksi khamir amilolitik indigenus Naiola, 2008
Seleksi terhadap 16 isolat khamir indigenus untuk mendapatkan khamir yang memiliki aktivitas amilolitik, dilakukan pengujian secara kualitatif. Strain
khamir 16 isolat ditumbuhkan pada cawan petri yang berisi media agar berpati bacto agar, pati 2, NaCl 5grl, kemudian diinkubasi ± 36 jam pada suhu 30ºC.
Cawan petri yang sudah ditumbuhi khamir ditetesi lugol. Isolat yang menunjukkan zona bening, mengindikasikan sebagai isolat khamir amilolitik.
Khamir amilolitik terpilih akan digunakan sebagai ko-kultur pada tahap prod uksi angkak oleh M. purpureus.
37
Seleksi khamir amilolitik
Khamir amilolitik terpilih
Fermentasi angkak oleh 6 strain M. purpureus indigenus Mp ko-kultur dengan khamir amilolitik
• Konsentrasi khamir :
10
3
, 10
4
, 10
5
• Waktu penambahan khamir : hari ke 2, 4, 6
fermentasi
cfuml
• Analisis intensitas pigmen merah, kuning, jingga
• Analisis kadar lovastatin
• Analisis kadar sitrinin
Gambar 3.1 Diagram alir penelitian
16 strain khamir
indigenus
Produksi angkak
Analisis stabilitas pigmen dan lovastatin
oleh pengaruh suhu dan pH
Analisis intensitas ekspresi gen penghasil
lovastatin
Isolasi total RNA, RT- PCR, elektroforesis
38
Produksi Angkak oleh M. purpureus
Ko-kultur dengan Khamir Amilolitik
Persiapan Starter Monascus purpureus
Tahap awal persiapan starter Monascus purpureus adalah pembuatan suspensi M. purpureus dari 6 strain yang digunakan yaitu TOS, JMBA 5K, AID
dan JMBA 3M, JmbA dan AS3K. Akuades steril sebanyak 2,5 mL dimasukkan ke dalam masing-masing biakan agar miring M. purpureus yang berumur 14
hari, kemudian dilakukan penggoresan sampai biakan terlepas sehingga diperoleh suspensi biakan M. purpureus . Untuk membuat starter, sebanyak 25 g beras
dalam cawan petri disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121 C selama 15
menit. Setelah disterilisasi, beras didinginkan sampai suhu 36 C. Beras
kemudian diinokulasi dengan suspensi M. purpureus sebanyak 2,5 mL dan diaduk merata menggunakan pengaduk steril. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 27-32
C selama 14 hari. Setelah berumur 14 hari atau lebih, siap digunakan sebagai starter untuk produksi angkak. Angkak kemudian dikeringkan sampai kadar air
5.
Persiapan Inokulum Khamir Amilolitik
Biakan agar miring khamir amilolitik terseleksi berumur 48 jam, ditambahkan 2,5 ml akuades steril, kemudian dilakukan penggoresan sampai
biakan terlepas sehingga diperoleh suspensi biakan khamir amilolitik. Tahap berikutnya dilakukan penghitungan total koloni khamir umumnya sekitar 10
6
cfuml, kemudian untuk membuat inokulum 10
5
cfuml, diencerkan dengan menambahkan 10 ml akuades steril. Pembuatan 10
4
cfuml inokulum dengan menambahkan 100 ml akuades steril, dan untuk 10
3
cfuml dengan menambahkan 1000 ml akuades steril.
Produksi Angkak Ko-kultur M. purpureus dengan
Khamir Amilolitik
Beras sebanyak 100 gr dalam erlemeyer 500 ml, disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit, kemudian didinginkan. Enam starter
M. purpureus 10
7
cfug masing-masing ditambahkan ke dalam beras sebanyak
39 ±10 bb, kemudian diaduk sampai merata dan diinkubasi selama 14 hari. Pada
hari ke 2, 4 dan 6 ditambahkan kultur khamir indigenus yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan konsentrasi yang divariasikan : 10
3
, 10
4
, 10
5
cfuml sebanyak 1 ml. Setelah 14 hari, angkak dipanen dan dikeringkan pada suhu ± 60
˚C sampai mencapai kadar air ± 5. Angkak yang sudah kering disimpan sebagai stok
sampel untuk kebutuhan analisis.
Analisis Analisis yang dilakukan pada angkak hasil ko-kultur meliput i : intensitas pigmen
merah, kuning dan jingga, kadar lovastatin, kadar sitrinin, intensitas ekspresi gen
penghasil lovastatin, stabilitas pigmen dan lovastatin oleh pengaruh suhu dan pH
34
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2001. Lovastatin. Wikipedia, the free encyclopedia Astuti, S., 2004, Seleksi Isolat Monascus purpureus Penghasil Lovastatin dan
Analisis Kadarnya, Program Studi Biokimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam FMIPA, IPB, Bogor
Blanc P.J. et al. 1994. Pigment of Monascus. J. Food Sci 59:862-865
Carels, M. dan D. sherpherd. 1977. The effect of different nitrogen sources on pigment production and sporulation of Monascus species in submerged
shaken culture. Can. J. Microbiol. 23: 1360-1372
Chul S. Shin , Hyung J. Kim, Moon J. Kim, Jae Y. Ju .1998. Morphological change
and enhanced pigment production of Monascus when cocultured with Saccharomyces cerevisiae
or Aspergillus oryzae.
Department of Biotechnology, College of Engineering and Bioproducts Research Center,
Yonsei University, Sodaemun-ku, Seoul 120-749, Korea Couch, R.D. and Gaucher, G.M., Rational elimination of Aspergillus terreus
sulochrin production. J Biotechnol 2004, 1082:171-178. Deanne, 1994, Produksi Pigmen Angkak oleh Monascus purpureus Pada Campuran
Limbah cair tahu, Ampas Tahu dan Dedak, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Dieter Wild, Gabor Toth, and Hans-Ulrich Humpf, 2002, New Monascus Metabolite Isolated from Red Yeast Rice Angkak, Red Koji, Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 2002, 50, 3999-4002
35 Dieter Wild, Gabor Toth, and Hans-Ulrich Humpf, 2003, New Monascus Metabolite
with a Pyridine Structure in Red Fermented Rice, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51, 5493-5496
Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar Universitas Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB. Bogor
Fauzi D. B., 1995, Toksisitas dan Imunogenitas Pigmen Angkak Yang Diproduksi Dari Kapang Monascus purpureus Pada Substrat Limbah Cair Tapioka
Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor Hassan Hajjaj, Alain Klaebe, Gerard Goma, Philippe J. Blanc, Estelle Barbier, and
Jean Francois. 1999. Biosynthetic Pathway of Citrinin in Filamentous Fungus Monascus ruber as Revealed by
13
C Nuclear Magnetic Resonance. Journal of Applied and Environmental Microbiology, January 1999, Vol.65,
No.1, p.311-314 Hassan Hajjaj, Alain Klaebe, Gerard Goma, Philippe J. Blanc, Estelle Barbier, and
Jean Francois. 2000. Medium-Chain Fatty Acids Effect Citrinin Production in the Filamentous Fungus Monascus ruber. Journal of Applied and
Environmental Microbiology March 2000, Vol.66, No.3, p.1120-1125
Hau Yin Chung, Wing Chi Joyce Ma, Joo-Shin Kim, and Feng Chen, Odor-Active Headspace Components in Fermented Red Rice in the Presence of a
Monascus Species, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52, 6557-6563
Heeyong Jung, Chulyoung Kim, Kun Kim, and Chul Soo Shin, Color Characteristics of Monascus Pigment with Various Amino Acids, Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 2003, 51, 1302-1306
36 Hesseltine, C.W. 1965. A millennium of fungi, food and fermentation. Mycologia.
57: 149-159
Ing-Kae Wang, Shoei- Yn Lin-Shiau, Ping-Chung Chen, and Jen-Kun Lin, 2000, Hypotriglyceridmic Effect of Anka a Fermented Rice Product of Monascus
sp in Rats, Journal Agric. Food , 2000, 48 3183-3189
Jiyuan Ma, Yongguo Li, Qing Ye, Jing Li, Yanjun Hua, Dajun Ju, Decheng Zhang, Raymond Cooper, and Michael Chang, 2000, Constituents of Red Yeast Rice,
a Traditional Chinese Food and Medicine, Journal Agric. Food , 2000, 48 5220-5225
Jonathan Kennedy, Karine Auclair, Steven G. Kendrew, Cheonseok Park, John C. Vederas, C. Richard Hutchinson .1999. Modulation of Polyketide Synthase
Activity by Accessory Proteins During Lovastatin Biosynthesis. Science
Judoamidjojo M, Abdul AD, Endang GS. 1992. Teknologi Fermentasi, Jakarta, Rajawali Pers
21May1999:Vol.284.no.5418,pp.1368-1372
Juzlova, P.T. Rezanka, L. Martinkova, and V. Kren, 1996, Long-Chain Fatty Acids From Monascus purpureus, Phytochemistry, vol. 43, No. 1, pp. 151-153
Jyh-Jye Wang and Tsu-Ming Pan,2003, Effect of Red Mold Rice Supplements on Serum and Egg Yolk Cholesterol Levels of Laying Hens, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51, 4824-4829 Ma, J., Y. Li, Q.Y. Ye, J. Li, Y. Hua, D. Ju, D. Zhang, R. Cooper and M. hang. 2000.
Constituents of Red Yeast Rice, A Traditional Chinese Food and Medicine. J. Agric. Food. Chem. 48: 5220-5225.
37 Mauliany, T, 2004, Analisis pigmen dan lovastatin Monascus purpureus Jmba pada
fermentasi padat beras merah Bah Butong dan BP 1804_1F_9, Program Studi Biokimia, Departemen Kimia FMIPA, IPB, Bogor
Mitrajanty K. D., 1994, Pengaruh Faktor Fisik dan Kimia Terhadap Mutu Pigmen Angkak Serta Stabilitasnya Selama penyimpanan Dalam Beberapa Jenis
Kemasan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Miyake, T., Ohno, S. Sakai, S. 1984. Process for the Production of Monascus pigment. US.Pat.4442 209
Omotainse S.O., Anosa V.O. , 1995, Leucocyte and Thrombocyte Responses in Dogs Experimentally Infected with Trypanosoma brucei, Revue Elev.Med. Vet.
Pays trop., 1995, 483: 254-258
Po-Shiuan Hsieh and Yueh-Hua Tai, 2003, Aquaeous Extract of Monascus purpureus M9011 Prevents and Reverses Fructose-Induced Hypertension in Rats,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51, 3945-3950
Prabawati E. K., 2005, Potensi Sari Buah Jambu Biji Untuk Meningkatkan Jumlah Trombosit Darah, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas
Teknologi Pertanian, institut Pertanian Bogor
Rachman, A. 989. Teknologi Fermentasi. Pusat Antar Universitas Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB. Bogor
Ridawati, 1993, Produksi Pigmen oleh Monascus purpureus BC 88202 Pada Media Campuran Limbah Cair Tapioka Ampas Tapioka dan Ampas Tahu,
Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor
38 Rombe, A., 2005, Kemampuan Angkak Dalam Meningkatkan Jumlah Trombosit
Tikus Putih Sprague Dawley, Program Studi Biokimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam FMIPA, IPB, Bogor
Russell J. Cox, 2000, Biosynthesis, Annu.Rep. Prog. Chem., Sect. B, 2000, 96, 231-258
San-Lang Wang, Wei-Jen Hsiao, and Wen-Teish Chang, 2002, Purification and Characterization of an Antimicrobial Chitinase Extracellularly Produced by
Monascus purpureus CCRC31499 in a Shrimp and Crab Shell Powder
Medium, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50, 2249-2255 Schmitt M., and Blanc P. 2001. Microbial Biotechnology Part 2. Innovative Aspects
in Biotechnology of Eukaryotes. Investpress Co., Sofia
Soedarmo, S.S.P., 1988, Demam Berdarah Dengue Pada Anak, Penerbit Universitas Indonesia UI-Press
Steinkraus K.H., 1983. Handbook of Indigenous Fermented Foods. Marcel Dekker, Inc
Yuan, C.S. 1980. Fermentative Production of Anka Pigments. Di dalam: Proceeding of the Oriental Fermented Foods. Bangkok. Thailand.
44
4. PENINGKATAN PRODUKSI PIGMEN ANGKAK OLEH Monascus purpureus KO-KULTUR DENGAN KHAMIR