Menyiapkan Sekuen Referensi Secara Manual atau dengan bantuan software Mendisain primer

18 Tahap-tahap dalam mendisain primer 1. Menentukan Tujuan Tujuan mendisain primer harus ditetapkan terlebih dulu sebelum melakukan kegiatan-kegiatan berikutnya.

2. Menyiapkan Sekuen Referensi

Pencarian sekuen referensi dapat dilakukan dari database GenBank di situs NCBI. Jumlah sekuen referensi bisa satu, dua atau lebih, s ebetulnya 1 sekuen sudah bisa dijadikan referensi asalkan yakin bahwa sampel target memiliki kesamaan spesies atau dengan kata lain secara genetik sangat mirip. Namun jika bisa memperoleh banyak sekuen tentu akan lebih baik agar dapat mendisain primer di daerah yang benar-benar sama conserved region setelah sekuen tersebut disejajarkan alignment

3. Secara Manual atau dengan bantuan software

. Pada dasarnya sembarang daerah tertentu pada sekuen referensi dapat dijadikan primer, tanpa perlu bantuan software khusus. Namun cara ini amat berisiko karena kita tidak mengetahui bagaimana kualitas primer nantinya sebab ada beberapa parameter yang harus diperhatikan dalam mendisain primer. Beberapa software dapat digunakan untuk membantu mendisain primer seperti PerlPrimer, Primer3Plus dan sebagainya. Tampilan Primer3Plus

4. Mendisain primer

sangat sederhana, namun kemampuannya sudah teruji dan digunakan oleh banyak peneliti di seluruh dunia. Langkah-langkah dalam mendisain primer menggunakan software Primer3Plus adalah sebagai berikut: 19  Pada kotak yang tersedia, dimasukkan sekuen referensi yang dipilih, atau dapat mengunggah upload sekuen dari file di komputer.  Primer yang ingin didisain dipilih, sense primer left primer, antisense right primer dan probe untuk hibridisasi internal oligo. Kotak yang ada di bawahnya dapat diisi jika sudah memiliki kandidat primer.  Beberapa parameter lain dapat ditentukan jika diperlukan seperti excluded region daerah dimana primer tidak boleh menempel di situ, targets primer harus mengapit daerah tersebut dan included region kedua primer harus berada di dalam daerah ini.  Beberapa opsi yang lebih mendalam dapat ditambahkan pula pada tab General Settings, Advance Settings, Internal Oligo, Penalty Weights dan Sequence Quality. Namun untuk saat ini dibiarkan dalam pilihan defaultnya.  Jika semua opsi sudah terisi, tombol PICK PRIMERS ditekan untuk memulai pencarian primer yang terbaik.  Hasil pencarian akan muncul pada halaman selanjutnya. Di sana tertera beberapa hal mengenai primer, yaitu: 20  Primer3Plus akan memberikan beberapa alternatif pasangan primer yang dapat dipilih. Pada gambar di atas terlihat pasangan primer pertama.  Nama Left Primer dan Right Primer  Sekuen kedua primer  Posisi primer pada sekuen referensi, panjang primer, Titik Leleh Tm, GC dan beberapa parameter terkait struktur sekunder yang mungkin terjadi.  Ukuran produk PCR Menguji spesifisitas primer Primer yang baru saja didesain harus diuji spesifisitasnya agar yakin bahwa primer- primer tersebut akan mengamplifikasi target yang diinginkan. Pengujian spesifisitas dapat dilakukan dengan bantuan BLAST di NCBI. 21 Pemilihan primer RT Ada tiga pilihan primer yang dapat digunakan seperti: oligo dT, random primer atau primer spesifik gen. Beberapa peneliti banyak menggunakan oligo dT karena bisa mendapatkan salinan cDNA lengkap dari full mRNA, akan tetapi, jika mRNA-nya panjang 4 kb atau tidak memiliki ekor poly A mRNA prokariot, maka pilihannya adalah random primer. Dengan random primer, ujung 5 ′ gen-gen yang panjang dapat ditranskripsi balik, tetapi cDNA yang diperoleh mungkin tidak full dari seluruh gen. Biasanya digunakan Pilihan ketiga adalah primer spesifik gen yang dapat meningkatkan sensitivitas dengan mengarahkan seluruh aktifitas enzim RT untuk mentranskripsi balik hanya RNA tertentu saja. Jika yang kita lakukan adalah one-step RT PCR, primer spesifik gen digunakan karena primer RT juga nantinya digunakan sebagai primer reverse pada reaksi PCR-nya. random primer 6-mers, namun apabila digunakan 8 atau 9-mers dapat meningkatkan ukuran cDNA karena primernya akan terhibridisasi lebih jarang. Aplikasi qPCR quantitative PCR pada gen-gen eukariot, hasil terbaik bisa diperoleh dengan menggunakan kombinasi random primer panjang dan oligo dT. Struktur Sekunder RNA Struktur sekunder ini bisa menjadi masalah dalam transkripsi balik RNA secara utuh. Ibarat menemui jalan buntu, enzim RT dapat berhenti ketika menemui struktur sekunder pada RNA-nya. Sulit memang memprediksi apakah RNA kita akan memiliki struktur sekunder, tapi biasanya kandungan GC yang tinggi bisa kita jadikan indikator bahwa RNA akan sulit untuk memisah dan mungkin tidak akan benar-benar menjadi utas tunggal sebelum reaksi. Untuk mengatasinya, bisa dengan melakukan denaturasi dulu pada suhu 65°C selama 5 menit sebelum reaksi RT agar RNA-nya dalam keadaan rileks. Pendekatan lainnya adalah dengan menggunakan enzim RT yang dapat bekerja pada suhu yang lebih tinggi dari RT standar. Ada juga enzim RT yang mampu menembus struktur sekunder RNA meski dilakukan pada suhu RT standar. 22 Menyingkirkan gDNA Kontaminasi DNA genom gDNA pada RNA merupakan salah satu penyebab terjadinya false positif saat reaksi PCR nantinya. Ada beberapa cara untuk menyingkirkan gDNA, misalnya pemberian DNase selama proses atau setelah isolasi RNA. Jika sampel RNA diisolasi dari sel eukariot, maka cara terbaik menghindari kontaminasi gDNA ketika PCR adalah dengan mendesain primer yang menyeberangi intron atau batas intron-exon. Seperti diketahui bahwa mRNA pada eukariot merupakan hasil transkripsi dari exon pada gDNA tanpa diselingi lagi oleh intron- intron. Dengan cara ini tidak akan terjadi amplifikasi terhadap gDNA atau setidaknya akan memiliki produk PCR yang berbeda ukurannya. Satu hal yang harus diwaspadai adalah pseudogene, yaitu salinan dari mRNA hasil splicing yang diinsersikan ke dalam genom. Primer yang didesain hanya untuk mRNA tadi tetap akan mengamplifikasi pseudogene ini. Untuk mRNA prokariot masalah tidak akan selesai dengan primer yang didesain menyeberangi intron karena gDNA prokariot tidak memiliki intron, sehingga penyingkiran gDNA ini amat krusial untuk keakuratan pengukuran ekspresi gen. Satu-satunya pilihan adalah reaksi enzimatik selama proses isolasi mRNA seperti yang diuraikan di atas. Harus dipastikan pula bahwa gDNA benar-benar tidak mengganggu amplifikasi, misalnya dengan buffer- buffer tertentu penghilang sisa-sisa DNA atau dengan mengamplifikasi PCR langsung RNA hasil isolasi tanpa melalui pros es RT PCR . Jika amplifikasi PCR tetap terjadi berarti gDNA masih ada di dalamnya . SITRININ Selama proses fermentasi, selain memproduksi pigmen dan lovastatin, Monascus sp juga menghasilkan toksin yang diberi nama sitrinin . Sitrinin dikategorikan sebagai mikotoksin yang mempunyai aktifitas sebagai hepatoksik, nephrotoksik, dan bakterisidal pada bakteri gram positif. Beberapa jamur yang mempunyai kemampuan memproduksi sitrinin, antara lain Penicillium P.fellutanum, P. lividum, P. implicatum, P. jenseni, P. citreoviride, P. steckii, P. 23 notatum, P. exposum, P. velutinum, P. camescen, P. viridicatum, P. palitans, P. claviforme , Aspergillus A. niveus, A. terreus, A. candidus Monascus. Clavariopsis aquatica dan Blennoria sp. Selain diproduksi sejumlah jamur, sitrinin juga dapat diproduksi dari daun-daunan di Australia Crotalaria crispata. Karakteristik Fisik dan Kimia Sitrinin Sitrinin berbentuk kristal, berwarna kukuningan, larut dalam pelarut lemak sedikit larut dalam air, larut dalam NaOH, Na 2 CO 3 atau larutan natrium asetat. Bersifat termolabil dalam asam atau larutan basa, berwarna oranye dalam larutan basa; coklat dalam FeCl 3 ; hijau dengan TiCl 3 , merah anggur dengan H 2 O 2 Sitrinin mempunyai titik cair 178 dan 179 C. Absorpsi ultra violet dalam etanol 955 adalah 222 ∈ = 4710 nm Cartwright et al., 1949., Hajjaj et al. yang diikuti dengan NaOH . Gambar 2.8 Struktur molekul sitrinin Hajjaj 2000 Daya Racun 1. Daya Racun Pada Binatang Penelitian yang telah dilakukan pada beberapa hewan percobaan menunjukkan adanya kerusakan pada ginjal hewan-hewan tersebut, data dapat dilihat pada tabel 2.1 . Dosis yang menunjukkan kemampuan sitrinin dalam membunuh atau menyebabkan kematian dari hewan percobaan LD 50 dapat dilihat pada tabel 2.2. 24 Tabel 2.1 Binatang percobaan, dosis dan pengaruh patologi pemberian sitrinin Jenis hewan percobaan Dosis mgkg BB Efek patologi Kelinci 20-75 20 8 minggu Pembengkakan ginjal Neukrosis akut Kerusakan ginjal kronis Depresi Glukose urea Tikus 48 14-32 2 hari 2 minggu Neukrosis akut Kerusakan ginjal kronis Babi 100 40 2 hari 5-6 minggu Neukrosis akut Kerusakan ginjal kronis Sumber: Wiley dan Morehouse 1977 2. Kandungan toksin pada urin Sitrinin yang disuntikkan pada beberapa hewan percobaan menyisakan residu sitrinin di dalam darah dan urin binatang tersebut. Kelinci yang mendapat suntikan 24-44 mgkg melalui intravenous, intramuskuler atau subkutan, maka dalam waktu 5 menit darah kelinci tersebut mengandung sitrinin dalam jumlah banyak berkisar antara 33 hingga 67 gml. Sitrinin akan bertahan dalam darah selama 24 jam. Bila diberikan melalui oral, darah kelinci dapat mengandung sitrinin sebanyak 15 sampai 20 gml dalam waktu 3 jam. Sekitar 20 sitrinin diikat plasma darah. Anjing yang diberi suntikan sitrinin melalui intravenous pada urinnya mengandung sitrinin sebanyak 22 persen setelah 48 jam.

3. Efek biologi lain