Prosedur Kerja .1 Penyiapan Bahan untuk Ekstraksi

4.3 Prosedur Kerja 4.3.1 Penyiapan Bahan untuk Ekstraksi Bahan berupa tanaman bakung putih Crinum asiaticum L. dalam keadaan segar dikumpulkan, dan dibersihkan dengan air. Bagian daun dan umbi bakung putih diseleksi lalu dirajang dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada suhu ruang dan terhindar sinar matahari langsung. Simplisia kering digiling dan disaring dengan menggunakan mesh no.2, sehingga diperoleh serbuk daun dan umbi bakung putih.

4.3.2 Ekstraksi dengan Pelarut Organik

Serbuk daun dan umbi bakung putih masing-masing sebanyak 700 g dimaserasi dengan menggunakan etanol 70 selama 5 hari, kemudian disaring dengan menggunakan kapas dan kertas saring. Tiap-tiap filtrat dipisahkan dari pelarutnya dengan menggunakan vaccum rotary evaporator pada suhu 50 C, sehingga diperoleh ekstrak kental daun dan umbi bakung putih.

4.3.3 Pemeriksaan Karakteristik Ekstrak Depkes RI, 2000

a. Organoleptik Pengujian ini dilakukan dengan mengamati bentuk warna, bau, dan rasa dari ekstrak yang dihasilkan. b. Rendemen ekstrak Rendemen ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih dihitung dengan membandingkan bobot awal simplisia dengan bobot akhir ekstrak yang dihasilkan. Bobot ekstrak yang dihasilkan Bobot awal simplisia c. Susut pengeringan Pemeriksaan ini dilakukan dengan cara menimbang ekstrak ± 0.5 g dan dimasukan kedalam botol timbang bertutup yang sebelumnya telah ditara. Kemudian dimasukan kedalam oven pada suhu 105 C hingga diperoleh bobot yang relatif tetap. b – c b – a Keterangan: a = bobot cawan kosong b = bobot sampel dan cawan sebelum dikeringkan dalam oven c = bobot sampel dan cawan setelah dikeringkan dalam oven

4.3.4 Penapisan Fitokimia

a. Identifikasi golongan alkaloid Masing-masing sebanyak 1 g ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih ditambahkan 1 ml HCl 2N dan 9 ml aquadest, kemudian dipanaskan diatas tanggas air selama 5 menit, didinginkan dan kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh dibagi menjadi 2 bagian. Filtrat pertama, ditambahkan 3 tetes pereaksi dragendorff, apabila terbentuk warna endapan orange-cokelat menunjukan adanya senyawa alkaloid. Filtrate kedua, ditambahkan 3 tetes pereaksi mayer, apabila terbentuk endapan putih atau kuning yang R endemen ekstrak = x 100 Susut pengeringan = x 100 ditambahkan dengan metanol kemudian endapan menjadi larut berarti menunjukan adanya senyawa alkaloid. b. Identifikasi golongan flavonoid Masing-masing ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih sebanyak 1 g ditambahkan 10 ml metanol mulut tabung ditutup dengan corong yang diberi kapas yang telah dibasahi, kemudian dipanaskan diatas tanggas air selama 10 menit, kemudian disaring dalam keadaan panas, filtrat kemudian diencerkan dengan 10 ml aquadest dan didinginkan, kemudian ditambahkan 5 ml n-heksan dan dikocok hati-hati, didiamkan sesaat kemudian dipisahkan lapisan n-heksan. Lapisan metanol kemudian dipekatkan, lalu ditambahkan 5 ml etil asetat dan disaring. Filtrate etil asetat dibagi menjadi 2 bagian. Filtrate pertama, sebagai kontrol. Filtrat kedua diuapkan dalam cawan sampai kering kemudian ditambahkan 2 ml etanol, kemudian ditambahkan 0.1 mg serbuk magnesium Mg dan 10 tetes ml HCl 2 N, terbentuknya warna merah jingga sampai merah ungu menunjukan adanya senyawa flavonoid, sedangkan terbentuknya warna kuning jingga menunjukan adanya senyawa flavon, kalkon, dan auron. c. Identifikasi golongan tanin Masing-masing ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih sebanyak 1 g ditambahkan 20 ml aquadest, kemudian dididihkan selama 30 menit. Kemudian ditambahkan 5 tetes larutan NaCl 10 kemudian didinginkan dan disaring. Filtrat dibagi 2, filtrat pertama sebagai kontrol, lalu sisa filtrat yang lainnya diuji dengan cara menambahkan 3 tetes FeCl 3 , kemudian dibandingkan dengan warna larutan kontrol. Warna biru hitam menunjukan adanya tanin terhidrolisis dan warna hijau kecoklatan menunjukan adanya tanin terkondensasi. d. Identifikasi golongan saponin Masing-masing ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih sebanyak 0,5 g ditambahkan 10 ml air panas, dan didinginkan, setelah dingin langsung dikocok kuat-kuat selama 10 detik, jika terbentuk buih yang stabil selama 10 menit setinggi 1-10 cm dan setelah ditambahkan 1 tetes HCl 2 N buihnya tidak hilang, maka menunjukan adanya senyawa saponin. e. Identifikasi steroid dan triterpenoid Masing-masing ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih sebanyak 1 g diekstraksi dengan n-heksan hingga tidak berwarna, kemudian residu ekstrak ditambahkan 10 ml kloroform dan diaduk selama 5 menit. Diambil lapisan kloroform dengan menggunakan pipet dan ditambahkan natrium sulfat anhidrat, disaring dan dibagi kedalam 2 bagian. Filtrat pertama sebagai kontrol, lalu sisa filtrat yang lainnya ditambahkan 3 tetes asetat anhidrida dan 1 tetes H 2 SO 4 pekat, dan diamati perubahan warna yang terjadi dengan kontrol. Jika terbentuk warna biru hijau atau merah ungu menunjukan adanya senyawa steroid atau triterpenoid.

4.3.5 Sterilisasi Alat dan Bahan

Semua alat dan bahan yang digunakan untuk uji mikrobiologi disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit, kecuali untuk bahan yang terbuat dari karet disterilkan dengan cara direndam dalam alkohol 70 dan jarum ose disterilkan dengan cara flambir pada nyala bunsen. Pengerjaan uji mikrobiologi dilakukan secara aseptis di dalam lemari aseptis yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol 70 , lalu disinari dengan lampu UV yang dinyalakan 15 menit sebelum digunakan.

4.3.6 Pembuatan Media Pertumbuhan

a. Brucella Agar Ditimbang 43 g Brucella Agar dan dilarutkan dengan 1 L aquadest dan dipanaskan hingga semuanya larut, kemudian ditambahkan 1 ampul vitamin K dan disterilkan dalam autoklaf. Setelah disterilkan kemudian didinginkan hingga suhu diperkirakan 47 C lalu ditambahkan darah domba sebanyak 5 vv, segera setelah tercampur homogen dituang kedalam tabung atau petri dan didiamkan hingga memadat. Komposisi Brucella Agar gL: Meet pepton 10 ; Casein pepton 10 ; Sodium clorida 5 ; Yeast extract 2 ; Dextrose 1 ; Sodium bisulfit 0,1 ; dan Bacteriological agar 15 . b. Agar darah Lab Ditimbang 37 g Blood Agar Base dan dilarutkan dengan 1 L aquadest dan dipanaskan hingga semuanya larut lalu disterilkan dalam autoklaf. Setelah disterilkan kemudian didinginkan hingga suhu diperkirakan 47 C lalu ditambahkan darah domba sebanyak 5 vv, segera setelah tercampur homogen dituang kedalam tabung atau petri dan didiamkan hingga memadat. Komposisi Blood Agar Base gL: Beef extract 10; Balanced pepton no.1 10; Sodium clorida 5; dan Agar no.2 12. c. Muller Hinton Agar Lab Ditimbang 38 gram MHA dan dilarutkan dengan 1 L aquadest dan dipanaskan hingga semuanya larut kemudian disterilkan dalam autoklaf. Komposisi Muller Hinton Agar gL: Beef infusion solids 2; Acid hydrolysed casein 17,5; Starch 1,5; dan Agar no.1 17. d. Brain Heart Infusion Merck Ditimbang 37 gram BHI dan dilarutkan dengan 1 L aquadest dan dipanaskan hingga semuanya larut lalu disterilkan dalam autoklaf. Komposisi BHI gL: Nutrient substrate extracts of brain and hearth and peptones 27,5; D-glukose 2; Sodium chloride 5; dan disodium hydrogen phosphate 2,5. e. Nutrient Broth Oxoid Ditimbang 13 gram NB dan dilarutkan dengan 1 L aquadest dan dipanaskan hingga semuanya larut lalu disterilkan dalam autoklaf. Komposisi Nutrient Broth gL: Lab-lemco powder 1; Yeast extract 2; Peptone 5; dan Sodium chloride 5.

4.3.7 Pembuatan Larutan Uji

Pada pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi cakram, larutan uji dibuat dengan melarutkan ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih menggunakan etanol 70 , dengan konsentrasi ekstrak etanol daun sebesar 30 bv dan ekstrak etanol umbi sebesar 60 bv. Pada penentuan Konsentrasi Hambat Minimum KHM dan Konsentrasi Bunuh Minimum KBM menggunakan metode dilusi cair, larutan uji dibuat dengan melarutkan ekstrak etanol daun dengan gliserin dan aquadest, sedangkan ekstrak umbi dengan aquadest.

4.3.8 Pembuatan Stok Bakteri

Bakteri uji diinokulasi pada medium Brucella Agar untuk bakteri P. acnes sedangkan medium MHA untuk S. aureus dan S. epidermidis dengan cara menggoreskan bakteri menggunakan jarum ose pada permukaan agar, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam dalam kondisi anaerob untuk P. acnes sedangkan untuk S. aureus dan S. epidermidis pada suhu 37 C selama 24 jam dalam kondisi aerob. 4.3.9 Pembuatan Suspensi Bakteri Biakan bakteri yang telah berumur 48 jam untuk P. acnes dan 24 jam untuk S. aureus dan S. epidermidis, diambil beberapa ose kemudian disuspensikan ke dalam larutan NaCl 0.9 dan diukur kekeruhannya dengan menggunakan nephelometer BD Phoenix dengan standar 0,5 Mc Farland diperkirakan 1,5 x 10 8 sel bakteri ml.

4.3.10 Pengujian Aktivitas Antibakteri

Pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih terhadap P. acnes, S. aureus dan S. epidermidis dilakukan dengan metode difusi menggunakan kertas cakram. Kertas cakram yang digunakan dibuat dari kertas whatman no.52 dengan diameter lingkaran 5.5 mm. Medium Brucella Agar untuk bakteri P. acnes dan medium MHA untuk S. aureus dan S. epidermidis yang masih berbentuk cairan dituang ke dalam cawan petri steril ± 20 ml dan dibiarkan memadat. Setelah agar memadat, suspensi bakteri sebanyak 100 µl disebar ke permukaan agar secara merata dengan menggunakan lidi kapas steril. Kertas cakram steril kemudian ditetesi dengan larutan uji sebanyak 10 µl kemudian didiamkan beberapa saat agar pelarutnya menguap kemudian diletakkan di atas permukaan agar. Untuk kontrol negatif digunakan etanol 70 pada setiap bakteri uji. Masing-masing cawan petri kemudian diinkubasi dalam keadaan posisi terbalik pada suhu 37 C selama 48 jam dalam kondisi anaerob untuk P. acnes sedangkan untuk S. aureus dan S. epidermidis pada suhu 37 C selama 24 jam dalam kondisi aerob. Aktivitas antibakteri diamati berdasarkan pengukuran diameter daerah hambat atau daerah bening yang terbentuk di sekeliling kertas cakram dikurangi dengan diameter cakram. Pengujian dilakukan 3 kali pengulangan.

4.3.11 Penetapan Potensi Relatif

Pengujian daya hambat klindamisin HCl dilakukan menggunakan metode difusi cakram seperti pada prosedur 4.3.10. Konsentrasi klindamisin HCl yang diujikan untuk P. acnes adalah 250 µgml; 200 µgml; 150 µgml; 100 µgml; dan 50 µgml. Sedangkan konsentrasi klindamisin HCl yang diujikan untuk S. aureus dan S. epidermidis adalah 20 µgml ; 15 µgml; 10 µgml; 5 µgml; dan 1 µgml. Sebagai kontrol negatif digunakan aquadest. Pengujian dilakukan 3 kali pengulangan. Penetapan potensi relatif ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih dibandingkan dengan klindamisin HCl dilakukan dengan cara memplotkan diameter hambat ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih kedalam persamaan garis hubungan antara konsentrasi klindamisin HCl dan daerah hambat. Potensi relatif diukur dengan membandingkan konsentrasi ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih yang memberikan diameter hambat yang sama pada daya hambat klindamisin HCl dengan konsentrasi ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih yang digunakan.

4.3.12 Penentuan Konsentrasi

Hambat Minimum KHM dan Konsentrasi Bunuh Minimum KBM Penentuan KHM dan KBM dilakukan dengan menggunakan metode dilusi cairbroth dilution test serial dilution. Konsentrasi larutan uji dibuat sebuah seri pengenceran pada medium cair dengan volume total 1 ml BHI untuk P. acnes sedangkan NB untuk S. aureus dan S. epidermidis dengan konsentrasi larutan uji 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 dan 0,3125 mgml untuk ekstrak etanol daun bakung putih, dan konsentrasi larutan uji 30; 15; 7,5; 3,75; 1,875; dan 0,9375 mgml untuk ekstrak etanol umbi bakung putih, yang kemudian ditambahkan dengan suspensi bakteri uji sebanyak 10 µl. Kemudian diinkubasi pada inkubator goyang 200 rpm suhu 37 C selama 48 jam dalam kondisi anaerob untuk P. acnes sedangkan untuk S. aureus dan S. epidermidis pada suhu 37 C selama 24 jam dalam kondisi aerob. Sebagai pembanding digunakan lima macam kontrol yaitu: a. Kontrol bakteri = 1 ml medium + 10 µl suspensi bakteri b. Kontrol negatif = 0,5 ml medium + 0,5 ml pelarut c. Kontrol pelarut = 0,5 ml medium + 0, 5 ml pelarut + 10 µl suspensi bakteri d. Kontrol medium = 1 ml medium e. Kontrol ekstrak = 0.5 ml media + 0.5 ml ekstrak Nilai KHM dan KBM terhadap bakteri uji ditentukan setelah larutan uji tersebut ditumbuhkan kembali pada medium agar Brucella Agar untuk P. acnes, sedangkan Agar darah untuk S. aureus dan S. epidermidis kemudian diinkubasi suhu 37 C selama 48 jam dalam kondisi anaerob untuk P. acnes sedangkan untuk S. aureus dan S. epidermidis pada suhu 37 C selama 24 jam dalam kondisi aerob. Nilai KHM dinyatakan sebagai konsentrasi terrendah ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji satu tingkat dibawah konsentrasi KBM, sedangkan nilai KBM dinyatakan sebagai konsentrasi terrendah ekstrak etanol daun dan umbi bakung putih yang tidak menunjukkan adanya pertumbuhan koloni bakteri pada agar. Pengujian dilakukan 3 kali pengulangan.

4.3.13 Analisis Kebocoran Asam Nukleat dan Protein

Suspensi bakteri dari kultur murni yang telah ditumbuhkan selama 48 jam untuk P. acnes. Selanjutnya ditambahkan ekstrak etanol daun bakung putih dengan konsentrasi 0 kontrol, 1, dan 2 KHM. Kemudian diinkubasi pada inkubator goyang 200 rpm suhu 37 C selama 48 jam dalam kondisi anaerob. Larutan uji disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit, kemudian dipisahkan supernatan dari endapan sel. Cairan supernatan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UVVIS Perkin Elmer lamda 25 pada panjang gelombang 280 dan 260 nm.

4.3.14 Analisis Kebocoran Ion Logam

Analisis kebocoran ion yang diukur adalah dalam bentuk ion K + dan Ca 2+ yang keluar dari sel bakteri akibat perlakuan dengan ekstrak etanol daun bakung putih. Sampel untuk analisis kebocoran ion logam berupa cairan supernatan yang berasal dari perlakuan pada prosedur 4.3.13. Cairan supernatan dianalisis dengan menggunakan Atomic Absoption Spectroscopy AAS Perkin Elmer.

4.3.15 Analisis Kerusakan Sel Menggunakan SEM Scanning Electron

Microscopy Pellet atau endapan sel yang berasal dari perlakuan prosedur 4.3.13 kontrol dan 2 KHM, direndam dengan glutaraldehid 2 selama semalam, lalu ditambahkan chocodylate buffer, dan direndam selama 20 menit. Larutan uji disentrifuse dan supernatan dipisahkan. Pellet direndam dalam 1 larutan osmium tetraoksida selama 1 jam, kemudian dikeringkan berturut-turut dengan alkohol 70 , 80 , 95 , dan alkohol absolut masing-masing selama 20 menit. Pellet disuspensikan dengan penambahan butanol, kemudian suspensi dioleskan pada cover slip yang telah direkatkan pada stub alumunium. Suspensi yang telah mongering di cover slip kemudian dilapisi dengan emas melalui proses vakum selama 20 menit dan diamati dengan menggunakan SEM JSM-5000.

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN