BAB III METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimental, meliputi pengumpulan bahan tumbuhan, pembuatan simplisia, karakterisasi dan skrining
fitokimia simplisia, pembuatan ekstrak etanol daun puguh tanoh, karakterisasi dan skrining fitokimia ekstrak, penyiapan hewan percobaan, perlakuan pada
hewan percobaan, pengukuran kadar nitrit dan nitrat plasma darah. Data hasil penelitian dianalisis dengan metode analisis variansi ANAVA dengan tingkat
kepercayaan 95, dilanjutkan dengan metode uji Duncan untuk melihat perbedaan nyata antar perlakuan menggunakan program SPSS Statistical
Product and Service Solution versi 17. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi, Laboratorium Farmakologi, dan Laboratorium
Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan Agustus 2012 sampai Maret 2013.
3.1 Alat – alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi blender Philip, lemari pengering Memmert, neraca listrik Mettler Toledo, neraca hewan
GW-1500, rotary evaporator Heidolph WB 2000, perkolator, water bath, hotplate, tanur Nabertherm, vortex V1 plus Boeco Germany, alat
sentrifugasi Dynamica, spektrofotometer UV-Visible Shimadzu, spuit, oral sonde, mortir dan stamfer, dan alat-alat gelas lainnya.
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan-Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bahan tumbuhan dan bahan kimia. Bahan tumbuhan yang digunakan adalah daun
puguh tanoh Curanga fel-terrae Merr.. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 96 teknis, pereaksi bouchardat, dragendorff, mayer, besi III klorida
4,5 bv, molish, timbal II asetat 0,4 M, asam sulfat 6 N, asam klorida 2 N, Lieberman-Burchard, toluen, kloroform, asam klorida, kloralhidrat, Na-CMC
Natrium-Carboxy Methyl Cellulose, larutan Doksorubisin HCl, asam asetat glasial 15, asam sulfanilat, N-1-naftil etilendiamina dihidroklorida NED,
dan akuades teknis.
3.3 Prosedur Pembuatan Simplisia 3.3.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan
Bahan tumbuhan yang digunakan adalah daun puguh tanoh Curanga fel-terrae Merr. yang segar. Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara
purposif tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan tumbuhan diambil dari Desa Tiga Lingga, Kabupaten Dairi, Provinsi
Sumatera Utara.
3.3.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi - LIPI Bogor. Identifikasi dilakukan oleh
Saudari Ramadhani Fithra.
Universitas Sumatera Utara
3.3.3 Pembuatan Simplisia
Bahan tumbuhan daun puguh tanoh yang masih segar dikumpulkan, dicuci bersih di bawah air mengalir, ditiriskan, dan ditimbang berat basahnya
2,935 kg. Daun puguh tanoh selanjutnya dikeringkan di lemari pengering hingga kering, dibuang benda-benda asing atau pengotoran-pengotoran lain
yang masih tertinggal pada simplisia sortasi kering, ditimbang berat keringnya 427 gram kemudian diserbuk dan disimpan dalam wadah plastik
yang tertutup rapat.
3.4 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia dan Ekstrak
Pemeriksaan karakteristik simplisia dan ekstrak meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut
dalam air, penetapan kadar sari larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan penetapan kadar abu tidak larut dalam asam WHO, 1998; Ditjen POM,
1995.
3.4.1 Pemeriksaan Makroskopik dan Organoleptik
Pemeriksaan makroskopik dan organolepik dilakukan dengan mengamati bentuk, bau, dan rasa dari daun puguh tanoh segar dan simplisia
daun puguh tanoh.
3.4.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia daun puguh tanoh. Daun puguh tanoh dipotong melintang lalu diletakkan di atas
kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop.
Universitas Sumatera Utara
3.4.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi toluena. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung
penyambung, tabung penerima 5 ml berskala 0,05 ml, alat penampung, dan pemanas listrik.
Cara kerja : Dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling ke dalam labu alas
bulat, lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluena dibiarkan mendingin selama 30 menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan
ketelitian 0,05 ml. Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15
menit. Setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan
dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit,
kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml.
Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO,
1998; Ditjen POM, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.4.4 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dan ekstrak dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter
dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat
pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang
telah dikeringkan WHO, 1998; Ditjen POM, 1995.
3.4.5 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dan ekstrak dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan
sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah
dikeringkan WHO, 1998; Ditjen POM, 1995. 3.4.6 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia dan ekstrak dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar
perlahan-lahan sampai arang habis, jika arang masih tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas, saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa
Universitas Sumatera Utara
dan kertas saring dalam krus yang sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Kadar abu dihitung terhadap
bahan yang telah dikeringkan WHO, 1998; Ditjen POM, 1995. 3.4.7 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar
abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO, 1998; Ditjen POM, 1995.
3.5 Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak
Skrining fitokimia serbuk simplisia dan ekstrak meliputi pemeriksaan senyawa golongan flavonoid, alkaloid, saponin, tanin, glikosida, dan
steroidtriterpenoid.
3.5.1 Pemeriksaan Flavanoid
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang 0,5 g, lalu ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas
melalui kertas saring. Filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling, setelah dingin ditambahkan 5 ml petroleum eter, dikocok hati-hati, lalu didiamkan
sebentar. Lapisan metanol diambil, diuapkan pada temperatur 40
o
C, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etilasetat, disaring. Filtratnya digunakan untuk uji
flavonoid dengan cara berikut :
Universitas Sumatera Utara
a. sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol 96, lalu ditambah 0,5 g serbuk Zn dan 2 ml asam klorida 2 N.
Didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida pekat. Jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif
menunjukkan adanya flavonoid glikosida-3-flavonol. b. sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 1-2 ml
etanol 96, lalu ditambah 0,1 g serbuk Mg dan 10 tetes asam klorida pekat. Jika terjadi warna merah jingga sampai warna merah ungu menunjukkan
adanya flavonoid. Jika terjadi warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon dan auron Ditjen POM, 1995.
3.5.2 Pemeriksaan Alkaloid
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan
di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk tes alkaloid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya
dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi : a. ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
b. ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c. ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari tiga percobaan diatas Ditjen POM, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.5.3 Pemeriksaan Saponin
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas,
didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan buih tidak hilang
dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Ditjen POM,1995.
3.5.4 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dan ekstrak disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak
berwarna. Diambil 2 ml larutan dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman
menunjukkan adanya tanin Ditjen POM, 1995.
3.5.5 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 96-air 7:3 dan 10 ml asam klorida
2 N, direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok,
didiamkan selama 5 menit, lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran kloroform-isopropanol 3:2 sebanyak 3 kali. Pada kumpulan sari lapisan
isopropanol diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dengan 2 ml metanol untuk larutan percobaan. 0,1 ml larutan percobaan
diuapkan diatas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes
Universitas Sumatera Utara
Molish, kemudian ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat, terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan, menunjukkan adanya ikatan gula Ditjen
POM, 1995.
3.5.6 Pemeriksaan Steroid Triterpenoid
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang sebanyak 1 g, dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, disaring. Filtrat diuapkan
dalam cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan pereaksi Liebermann- Burchard melalui dinding cawan. Apabila terbentuk warna ungu atau merah
yang berubah menjadi biru ungu atau biru hijau menunjukkan adanya triterpenoidsteroid Harborne, 1987.
3.6 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Puguh Tanoh
Sebanyak 300 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana tertutup dan dibasahi dengan etanol 96, kemudian dimaserasi selama 3 jam. Massa
dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-hati, kemudian cairan penyari dituangkan secukupnya sampai cairan mulai
menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, perkolator ditutup dan dibiarkan 24 jam. Cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml
tiap menit, cairan penyari ditambahkan berulang-ulang secukupnya dengan memasang botol cairan penyari di atas perkolator dan diatur kecepatan
penetesan cairan penyari sama dengan kecepatan menetes perkolat, sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan jika
perkolat yang keluar telah jernih. Perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator Ditjen POM, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.7 Pembuatan Pereaksi
Kategori