Semua tikus diberi ransum standar dan air minum ad libitum. Kultur Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus fermentum yang diberikan sebanyak 1
mL dengan populasi 10
8
cfumL, sedangkan kultur enteropathogenic E. coli yang digunakan sebanyak 1 mL dengan populasi 10
6
cfumL untuk satu kali cekok. Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, dan EPEC diberikan pada
tikus percobaan secara per oral menggunakan sonde lambung Oyetayo 2004. Proses terminasi pengakhiran perlakuan dan sampling organ usus halus
dilakukan tiga kali, yaitu pada hari ke-8 T1, hari ke-15 T2, dan hari ke-22 T3. Saat tikus diterminasi, organ usus halusnya diambil kemudian dicuci
dengan NaCl 0.9. Organ lalu disimpan dan difiksasi selama 24 jam dalam larutan Bouin untuk mencegah terjadinya autolisis.
4. Pemrosesan jaringan Kiernan 1990
Organ usus halus yang telah difiksasi kemudian dipotong dan diambil masing-masing bagianya duodenum, jejunum, dan ileum. Potongan jaringan
duodenum, jejunum, dan ileum kemudian didehidrasi penarikan molekul air dari dalam jaringan dengan alkohol bertingkat 70, 80, 90, 95 masing-
masing selama 24 jam dan alkohol absolut I, II, dan III masing-masing selama 1 jam. Selanjutnya dilakukan penjernihan clearing dalam larutan xylol I, II, III,
masing-masing selama 1 jam. Tahap berikutnya adalah infiltrasi parafin kedalam jaringan dengan
memasukkan sampel jaringan ke dalam parafin cair I, II, III, masing-masing selama 1 jam dengan suhu 60
o
C. Setelah itu dilakukan penanaman organ dalam parafin embedding, kemudian dibuat blok-blok jaringan sesuai ukuran organ.
Blok jaringan dipotong setebal 4 µm dengan mikrotom putar. Hasil potongan direndam dalam akuades suhu ruang, kemudian dimasukkan ke dalam akuades
yang dipanaskan dalam waterbath suhu 37
o
C. Selanjutnya potongan jaringan terbaik diletakkan pada gelas objek. Untuk pewarnaan imunohistokimia, gelas
objek yang digunakan dilapisi dilem dengan neophren in toluene neophren : toluene = 0.2 mL : 1.8 mL. Preparat kemudian dimasukkan ke dalam inkubator
40
o
C selama minimal 24 jam.
5. Pewarnaan
Pewarnaan dimulai dengan deparafinisasi potongan jaringan dalam xylol III, II, I masing-masing 5 menit. Rehidrasi jaringan dilakukan dengan merendam
preparat dalam alkohol absolut III, II, I, 95, 90, 80, 70 masing masing 3 menit. Setelah itu dilakukan pencucian dengan air kran selama 5 menit
dilanjutkan pencucian dengan akuades selama 3 menit. 5.1
Pewarnaan hematoksilin-eosin HE Kiernan 1990 Pewarnaan jaringan diawali dengan pemberian hematoksilin selama 3 menit,
lalu direndam dalam air kran selama 10 menit dan akuades 5 menit, dilanjutkan dengan pemberian Eosin selama 2 menit. Tahap pewarnaan diakhiri dengan
dehidrasi pada alkohol bertingkat 70, 80, 90, 95, absolut I, II masing- masing beberapa detik, kemudian absolut III satu menit. Dilanjutkan dengan
clearing pada xylol I, II, beberaapa detik dan xylol III satu menit, diakhiri dengan mounting penutupan sediaan dengan coverglass.
5.2
Pewarnaan imunohistokimia cooper,zinc superoxide dismutase Cu,Zn-
SOD Wresdiyati et al. 2002 Proses pewarnaan imunohistokimia diawali dengan tahap penghilangan
peroksidase endogen dengan merendam preparat dalam campuran metanol 30 mL dan H
2
O
2
0.3 mL selama 15 menit. Kemudian dilakukan pencucian dengan akuades dan PBS masing-masing dua kali selama 10 menit. Setelah itu, setiap
preparat ditetesi dengan 50-60 µl serum normal dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 60 menit. Lalu dilakukan pencucian dengan PBS sebanyak tiga kali
masing-masing 5 menit. Tahap selanjutnya adalah penetesan antibodi primer Cu,Zn-SOD SIGMA S2147 sebanyak 50-60 µl pada masing-masing preparat,
lalu diinkubasi pada suhu 4
o
C selama 2 malam 44 jam. Setelah inkubasi, preparat dicuci dengan PBS sebanyak tiga kali masing-
masing selama 10 menit. Selanjutnya preparat ditetesi dengan 50-60 µl antibodi sekunder Dako Envision Peroxidase System K1491 pada kondisi gelap,
kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37
o
C. Sediaan dicuci kembali dengan PBS sebanyak tiga kali masing-masing selama 5 menit. Setelah itu,
dilakukan visualisasi dengan meneteskan kromogen DAB+H
2
O
2
ke preparat pada kondisi gelap dan diamkan selama 30 menit pada suhu ruang. Preparat lalu dicuci
dengan air bebas ion MiliQ sebanyak tiga kali masing-masing 5 menit. Preparat tersebut kemudian diwarnai di-counterstain dengan hematoksilin agar terlihat
warna yang kontras antara inti sel yang mengadung SOD dan yang tidak. Preparat lalu dicelupkan ke dalam akuabides untuk memperkuat warna biru yang dibentuk
oleh hematoksilin. Selanjutnya preparat didehidrasi pada alkohol bertingkat 70, 80, 90, 95, dan absolut I, II masing-masing beberapa detik, kemudian
absolut III selama 1 menit. Proses dilanjutkan dengan clearing pada xylol I, II beberapa detik dan xylol III selama 1 menit, dan diakhiri dengan mounting.
6. Analisis data
